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Characterization of the role of ageing on mechanical and thermal nociception and nocifensive response to formalin test in C57BL/6 Mice
(2014-10-27) Scuteri, Damiana; Sisci, Diego; Berliocchi, Laura
Il dolore cronico, che riduce notevolmente la qualità della vita, interessa un vasto segmento della popolazione globale (il 25% della popolazione Europea e più di 100 milioni di cittadini Americani), diventando anche più frequente negli anziani (> 65 anni). In questa popolazione, il dolore cronico spesso viene incompreso e non opportunamente trattato (Bruckenthal & D’Arcy, 2007), anche a causa della resistenza alla maggior parte degli analgesici di elezione. Pertanto, questo progetto di dottorato è stato condotto con l’obiettivo di caratterizzare un modello di dolore cronico che potesse essere un valido strumento rappresentativo della condizione di dolore cronico nell’anziano ed il ruolo dell’invecchiamento nella nocicezione meccanica e termica e nella risposta nocifensiva in topi C57BL/6. Topi C57BL/6 di due mesi di età sono stati sottoposti al Test della Formalina (Dubuisson & Dennis, 1977): oltre a studiare il comportamento nocifensivo di licking/biting/flinching indotto dalla formalina, l’allodinia meccanica e l’edema sviluppati dagli animali in seguito alla somministrazione di formalina sono stati rispettivamente investigati tramite il Test di Von Frey (Chaplan et al., 1994) e l’utilizzo di un calibro, nel 1°, 4°, 7°, 9°, 11° e 14° giorno successivo alla somministrazione di formalina. Inoltre, è stata studiata l’efficacia del gabapentin, uno dei trattamenti di scelta per gli stati di dolore cronico come la neuropatia diabetica e la nevralgia postherpetica (Backonja et al., 1998; Rowbotham et al., 1998), sia nella risposta nocifensiva al test della formalina sia nella conseguente allodinia meccanica, fino a 4 giorni dopo l’iniezione di formalina. I risultati ottenuti hanno dimostrato la presenza di allodinia meccanica nella zampa ipsilaterale già due ore dopo la somministrazione di formalina, con il picco nel 4° giorno. Questa allodinia meccanica a lungo termine (fino a 14 giorni), nel 4° giorno successivo all’iniezione di formalina, interessa anche la zampa controlaterale, confermando l’esistenza di meccanismi centrali ritenuti alla base della seconda fase del test della formalina ed escludendo la possibilità che tale allodinia possa essere causata dall’edema evidenziato. Il gabapentin è risultato molto efficace nella seconda fase, lievemente efficace nella prima fase e nell’allodinia meccanica indotta dalla formalina 2 ore dopo la somministrazione di formalina. Tale attività non è stata evidenziata nel primo e nel quarto giorno successivo all’iniezione di formalina, verosimilmente a causa dell’emivita del farmaco. I nostri risultati caratterizzano il test della formalin come un modello rappresentativo di uno stato di dolore cronico che racchiude sia le caratteristiche infiammatorie del dolore articolare, spesso resistente al trattamento (Scaglione et al., 2014), sia gli aspetti centrali del dolore neuropatico, perciò molto utile per studiare le condizioni di dolore cronico che affliggono un crescente numero di pazienti anziani. Inoltre, il quadro fisiopatologico del dolore nell’anziano è stato approfondito per comprendere come l’invecchiamento potesse influenzare prima la nocicezione e, successivamente, lo sviluppo ed il mantenimento del dolore, dal momento che i cambiamenti nella nocicezione indotti dall’età non sono ancora ben noti (Taguchi et al., 2010). Pertanto, topi C57BL/6 giovani (2 mesi) e più anziani (6, 12 e 18 mesi) sono stati sottoposti a test comportamentali per determinare la sensibilità basale meccanica e termica (test di Von Frey (Chaplan et al., 1994), Pin-prick test (Chan et al., 1992), test di Hargreaves (Hargreaves et al., 1988), test dell’acetone (Choi et al., 1994)). Come dimostrato anche da studi longitudinali, soprattutto la sensibilità meccanica ed anche quella termica (sia al caldo che al freddo) sono risultate incrementate. I primi cambiamenti evidenti, in particolare per la sensibilità al freddo, sono stati osservati intorno ai 6 mesi di età. Fra l’età di 12 e di 18 mesi, i livelli di sensibilità hanno mostrato una sorta di plateau, con un incremento molto più lento. Poiché la nocicezione è risultata essere modificata negli animali anziani, si è deciso di esaminare l’effetto dell’età sulla risposta nocifensiva al dolore evocato (test della formalina). La risposta nocicettiva, espressa in secondi di licking/biting/flinching e come totale di eventi di licking/biting/flinching, è risultata differente nei topi anziani (6, 12, 18 mesi), presentando non più solo 2 ma 3 fasi di picco, uno spostamento temporale ed un’ampiezza variata. Inoltre, lo stato allodinico formalina-indotto è risultato più pronunciato nei topi anziani, nei quali l’allodinia meccanica ha continuato ancora a rimanere stabile al picco, mentre nei topi di due mesi il recupero stava già cominciando. Anche il processo di guarigione e l’edema della zampa sono risultati influenzati dall’età dell’animale. A livello molecolare, non sono state evidenziate differenze significative nei livelli della proteina p62, di LC3- I e di LC3-II, mentre solo i livelli di espressione di Beclin 1 sono risultati progressivamente ridotti con l’invecchiamento, in maniera statisticamente significativa. Sebbene siano necessari ulteriori esperimenti, questi risultati sembrano suggerire che la pathway dell’autofagia sia modificata e che il flusso autofagico sia probabilmente ridotto. Di fondamentale importanza è l’osservazione che il principale marker di dolore cronico, la subunità del canale del Ca2+ α2δ-1, è risultata quasi assente nei topi di 2 mesi e notevolmente up-regolata, seguendo un andamento a campana, nei topi di 6 e di 12 mesi. Questo fenomeno potrebbe essere alla base della ridotta soglia meccanica dei topi più anziani. Inoltre, una nuova banda a basso peso molecolare, che abbiamo chiamato α2δ-1*, è risultata altamente presente nei topi più anziani rispetto ai topi di due mesi, come la banda nota α2δ-1. I nostri risultati hanno dimostrato che anche l’efficacia del gabapentin (10 e 100 mg/Kg) nel test della formalina e nell’allodinia meccanica indotta dalla formalina, testato in topi C57BL/6 di 2 e 6 mesi, è risultata influenzata dall’invecchiamento. In particolare, nei topi giovani, solo la dose di 100 mg/Kg è risultata efficace in tutte le fasi del test della formalina, mentre, sia la dose più alta che la dose più bassa sono state efficaci nei topi di 6 mesi. A differenza dei topi di due mesi, i topi di 6 mesi non hanno mostrato cambiamenti significativi fra la soglia meccanica dei topi trattati con veicolo e quella dei topi trattati con il farmaco due ore dopo la somministrazione di formalina. Tuttavia, la somministrazione acuta di gabapentin è risultata più efficace sull’allodinia meccanica indotta dalla formalina nei topi di 6 che nei topi di 2 mesi, suggerendo che nei topi anziani, anche una dose più bassa di gabapentin risulta terapeutica ma l’effetto terapeutico ha più breve durata. Questo fenomeno potrebbe essere dovuto all’up-regulation della subunità α2δ-1 evidenziata nei topi anziani. In conclusione, i risultati ottenuti durante questo progetto di ricerca di dottorato caratterizzano il test della Formalina (Dubuisson & Dennis, 1977) come un valido modello di dolore cronico e dimostrano che il processo di invecchiamento influenza la soglia nocicettiva agli stimoli sia di natura meccanica che termica ed il comportamento nocifensivo in tale modello sperimentale di dolore cronico. I nostri risultati sono dotati di un notevole valore traslazionale per rispondere al bisogno, non ancora soddisfatto, di un migliore sfruttamento degli strumenti farmacologici già disponibili e di nuovi trattamenti terapeutici per la gestione del dolore cronico nei pazienti anziani.
Study of autophagic and epigenetic mechanisms in experimental models of inflammatory and neuropathic pain for the identification of new pharmacological targets
(2013-11-28) Maiarù, Maria; Sisci, Diego; Berliocchi, Laura
Pain is defined by IASP as “an unpleasant sensory and emotional experience associated with actual or potential tissue damage, or described in terms of such damage” (IASP, 2011). While physiological pain is like a warning system, useful to prevent damage to the organism, pathological pain is an unpleasant sensation, permanent also after damage and it is characterized by an enhanced sensitivity to both innocuous and noxious stimuli (termed allodynia and hyperalgesia, respectively). While acute pain resolves in few days, chronic pain lasts longer than three/six months. Neuropathic pain, a common form of chronic pain, was defined as “pain caused by a lesion or disease of the somatosensory nervous system” (IASP, 2011). Pharmacological treatments available, including tricycles antidepressant and gabapentin, have limited efficacy in most of patients (Childers et al, 2007). Therefore, a better understanding of pain physiopathology and the development of new treatments are very important. Here, we characterised two new molecular mechanisms, autophagy and epigenetic mechanisms, and their role in pain processing. Autophagy is the main mechanisms involved in the degradation of proteins and organelles, in cell remodelling and survival during periods of nutrient deficiency. The decrease in the autophagic activity seems to interfere with the degradation of proteins and with the turnover of nutrients, while a greater activation of this pathway appears to facilitate the clearance of protein aggregates and to promote neuronal survival in various neurodegenerative diseases. On the other hand, too high autophagic activity can be detrimental and lead to cell death, suggesting that the regulation of autophagy has an important role in determining cell fate. However, despite numerous studies on the role of autophagy in neurodegenerative diseases, the role of this process in the pathophysiology of neuropathic pain remains poorly studied. Epigenetic mechanisms are chemical modifications of chromatin that influence gene expression without altering the DNA sequence. Although in recent years scientific research has produced significant results in the epigenetics field, only few studies have focused on the involvement of epigenetic mechanisms in relation to pain states. Experimental evidence suggests that changes in the expression of some genes are involved in the early stages of induction and maintenance of chronic pain states. Among these genes, recent evidence suggests a role for the FKBP5 gene, an important regulator of the glucocorticoid receptor, involved in the regulation system of the stress response. In addition, recent studies show that this gene is under strong epigenetic control. In view of this, the objectives of this research were: • To characterise the autophagic process at spinal cord level in different experimental models of neuropathic and inflammatory pain; • To verify the relevance of spinal autophagy for pain processing; • To identify pain conditions in which the gene FKBP5 plays a role; • To study the role of FKBP5 on pain processing at spinal cord level; • To characterize the enzymes involved in DNA methylation; The results obtained in the first experimental part of this thesis showed a modulation of the main autophagic markers in experimental models of neuropathic pain. In particular, in the model that involves the ligation of the L5 spinal nerve (SNL) and in the model that involves the transection of the tibial nerve and peroneal (SNI), it was observed an increase in the levels of the associated form of the protein LC3 (LC3II ) and of protein p62 , which is involved in the early stages of degradation of the autophagic process. The observed increase in p62 protein levels suggested a possible impairment of autophagic flux. To verify this hypothesis the consequences of a local block of autophagy at spinal level were investigated on pain behaviour. In particular, the treatment of naïve animals with chloroquine, a lisosomal inhibitor, resulted in the establishment of a state of hyperalgesia typically observed after peripheral damage of the spinal nerves. The results obtained in the second experimental part demonstrate an involvement of the gene FKBP5 in the induction and in the maintenance phases of chronic pain. In particular, knockout animals have shown a lower sensitivity to mechanical stimuli following the onset of various chronic pain states. The silencing of the gene at the spinal cord level has allowed us to understand the role of the gene FKBP5 in pain processing after an injury. Finally, the study and characterization of DNMT1, the enzyme involved in DNA methylation, has allowed us to suggest the active involvement of other proteins in the process of DNA demethylation and then in the expression of genes. In conclusion, the data reported in this study indicate an impairment of autophagy in experimental models of neuropathic pain, supporting the neuroprotective role of this process in the spinal cord. It was also demonstrated the involvement of the gene FKBP5 in the induction and in the maintenance phases of chronic pain. Altogether, these data pave the way to further investigations aimed to a better understanding of the mechanisms underling chronic pain and to the identification of potential molecular targets for the development of new therapeutic strategies