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Alterazioni morfo-funzionali del fegato e dell'apparato branchiale di zebrafish (Danio rerio) dopo esposizione a cloruro di mercurio
(2017-06-09) Maricella, Rachele; Canonaco, Marcello; Brunelli, Elvira
Alterazioni morfo-funzionali indotte da contaminanti ambientali in due specie di Teleostei
(2017-11-26) Madeo, Giuseppe; Canonaco, Marcello; Brunelli, Elvira; Bernabò, Ilaria
Azione cardiaca della catestatina in Rana esculenta
(2014-03-26) Barbieri, Sandra Francesca; Canonaco, Marcello; Gattuso, Alfonsina; Mazza, Rosa
Carabid beetles as natural antagonists of the olive fly Bactrocera oleae Rossi 1790
(2014-03-20) Odoguardi, Rosalba; Canonaco, Marcello; Zetto, Tullia; Bonacci, Teresa
Caratterizzazione molecolare e funzionale degli amebociti di Ciona intestinalis nella risposta immune mediata dal sistema del complemento
(2014-03-25) Giacomelli, Stefano; Canonaco, Marcello; De Santis, Rosaria; Pinto, Maria Rosaria
Research over the past ten years indicates that the Complement System, the major effector arm of the vertebrate innate immunity, emerged at least 1,300 million years ago, long before the appearance of the adaptive immune response. These studies also pointed to the ascidian Ciona intestinalis (Urochordata), which occupies a key phylogenetic position in chordate evolution, as a suitable animal model for investigating the immune system evolution. In this context, two C3-like molecules, CiC3-1 and CiC3-2, exhibiting all the characteristic features of the mammalian C3s, have been previously identified, sequenced, and characterized in C. intestinalis. Furthermore, it has been found that the activation of CiC3-1 results in the release of the bioactive fragment C3-1a, a potent mediator of inflammatory reactions. The C3-1a fragment exerts its functional activity through the specific binding to a cell surface G protein-coupled seven-transmembrane receptor (CiC3aR), which has been more recently identified and characterized. Both C3-1a and its receptor are expressed only by granular and hyaline amoebocytes, two renewing blood cell types. In Ciona, blood cell proliferation occurs in circulating blood and in lymph nodules, mainly localized in the pharynx. In the present study I have first of all assessed whether Ciona C3 could represent an early molecular marker of amoebocyte proliferation in pharyngeal limph nodules. Using real-time PCR analysis I have found that CiC3-1 is constitutively expressed in the pharynx and that its expression is up-regulated by the treatment of the animals with lipopolysaccharides (LPS), a well-known inflammatory agent. By using two specific anti-C3 and anti-C3a polyclonal antibodies in immunohistological staining of pharynx sections, I have found that also the gene product is present in the pharynx, localized in areas identified as sites of hematogenic activity, and in amoebocytes occupying the pharyngeal bars. The same antibodies used in Western blot analysis indicated that CiC3-1 and its activation products, namely CiC3-1b and CiC3-1a, are present in homogenates of pharynx. The finding that the amount of the bioactive fragment CiC3-1a increases in the pharynx of LPS treated animals, clearly indicates that CiC3-1, present in the pharynx and labeling the maturing amoebocytes, is functionally active. The identification in C. intestinalis of both the partners participating in the complement-mediated inflammatory response gave me the opportunity for further investigating the C3a-C3aR interaction at both the molecular and cellular levels. In another series of experiments, I have focused my attention on cellular mechanisms acknowledged to be fundamental in ligand-receptor interaction. I have analyzed by confocal microscopy the dynamic process of internalization of the CiC3aR, induced by the binding of CiC3-1a in the form of the eighteen amino acid C-terminal peptide CiC3-1a59-76 of CiC3-1a fragment. These experiments have been performed on amoebocytes of circulating blood, which constitutively express both CiC3-1 and CiC3aR. Results of these experiments indicate that CiC3aR, following the agonist stimulus, is internalized in few minutes, and recycled to the cell surface within 30 min, made again available for CiC3-1a binding. My observations also revealed that in response to CiC3aR activation, Ciona arrestin (CiArr) is translocated to the plasma membrane in 30 sec. This localization profile is consistent with the participation of CiArr in CiC3aR internalization, and suggests, for the first time in Ciona, a role for CiArr as the agonist driven switch initiating receptor endocytosis.
Cateslytin and Chromofungin, two CgA derived peptides: actors of the immune and cardiac systems
(2017-05-03) Scavello, Francesco; Canonaco, Marcello; Angelone, Tommaso; Schneider, Francis; Metz-Boutigue, Marie-Hélène
Chromogranin A (CgA) belongs to the granin family of uniquely acidic secretory that are ubiquitous in secretory cells of the nervous, endocrine, immune system. Numerous cleavage products of the granins have been identified, some of these peptides showed biological activities and are costored in secretory granules of different cells. Chromofungin (Chr: CgA47-66) and Cateslytin (Ctl: CgA344–358) are peptides that display antimicrobial activities and activate neutrophils, with important implications in inflammation and innate immunity. Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen and the leading cause of a wide range of severe clinical infections and one of the most important cause of hospital-acquired infections, in fact infections caused by this bacterium have classically an important impact in morbidity and mortality in the nosocomial and community scene. Furthermore, this pathogen is the primary cause of surgical site infections and the most frequently isolated pathogen in Gram-positive sepsis. In the specific field of cardiovascular disease S. aureus leading infective cause of destruction of endocardial tissue after implantation of prosthetic heart valve. This pathogen is also notorious for its ability to resist the available antibiotics and dissemination of various multidrug-resistant S. aureus clones that limit therapeutic options for a S. aureus infection. Aslam et al. in 2013 shown that Ctl is resistant to the degradation of S. aureus protease and is the most antibacterial CgA derived peptide against this bacterium. The aim of study was to evaluate the: 1) Effects of Chr on isolated and Langendorff perfused rat hearts in basal and pathological conditions; 2) In vitro antibacterial activity of a synthetic Cateslytin-derived peptide to cover artificial heart valves and prevent infection by S. aureus; 3) In vivo antibacterial activity of Ctl in rat infected with S. aureus. The first part of the study was performed by using the isolated and Langendorff perfused rat hearts, Elisa assay and real-time PCR. We found that, under basal conditions, increasing doses (11–165 nM) of Chr induced negative inotropic effects without changing coronary pressure. The AKT/eNOS/cGMP/PKG pathway mediated this action. We also found that Chr acted as a postconditioning (PostC) agent against ischemia/reperfusion (I/R) damages, reducing infarct size and LDH level. Cardioprotection involved PI3K, RISK pathway, MitoKATPand miRNA-21. Therefore, we suggest that Chr directly affects heart performance, protects against I/R myocardial injuries through the activation of prosurvival kinases. Results may propose Chr as a new physiological neuroendocrinemodulator able to prevent heart dysfunctions, also encouraging the clarification of its clinical potential. In the second part of the study, two new synthetic peptides containing Ctl (RSMRLSFRARGYGFR) were designed: D*T*Ctl (DOPA-K-DOPA-K-DOPATLRGGE- RSMRLSFRARGYGFR), T*Ctl (TLRGGE-RSMRLSFRARGYGFR) with D*: DOPA-K-DOPA-K-DOPA and T*: TLRGGE. This study is based on the observation of the adhesive properties of the DOPA-K-DOPA-K-DOPA sequence and on the ability of S. aureus endoprotease Glu-C to cleave the TLRGGE sequence. Firstly, using techniques of biochemistry, proteomics (sequencing, mass spectrometry) and microbiology we shown that the digestion by the Glu-C protease of T*Ctl and D*T*Ctl is able to release active Ctl. The prediction analisys of the secondary structure suggested the presence of an alpha helix domain in the case of D*T*Ctl with respect to T*Ctl. The D* group stabilized the secondary structure and facilitated the cleavage by Glu-C to the release of the active peptide Ctl. Subsequently, the effect of the oxidation by NaIO4 of D*T*Ctl on the release of Ctl and the antibacterial activity was analized. Proteomic analysis showed the formation of polymers inhibiting the action of Glu-C and the release of Ctl. We also shown that D*T*Ctl had a MIC value around 75 μM against different strains of S. aureus. This data shown that D*T*Ctl had a direct action against the bacteria without Glu-C cleavage. However, in oxidizing conditions the formation of aggregates of D*T*Ctl reduced the antibacterial action of this synthetic peptide. In the last part of this thesis, we evaluated the in vivo antibacterial activity of Ctl and whether and to which extent Ctl elicit cardioprotection in rat infected with S. aureus, as a model of infection with this bacterium. Identification of specific molecular targets of tissue and systemic inflammation and damage were analysed by Western blotting, ELISA and microbiological analysis in cardiac homogenates and plasma. A strong reduction of plasma bacterial growth, TNF-α, IL-1β and LDH plasma levels was observed in infected rat treated with Ctl. Western blotting analysis of cardiac extracts showed that Ctl treatment is accompanied by reduction of expression of pro-inflammatory markers, such as iNOS and COX-2. These preliminary data suggest that in vivo Ctl treatment is able to counteract the deleterious effects of S. aureus, and elicits myocardial protection.
Design and development of membranes for CO2/CH4 separation
(2015-12-16) Esposito, Elisa; Canonaco, Marcello; Curcio, Stefano; Jansen, Johannes Carolus
The objective of this work is to compare different membrane materials and different operation modes for the separation of CO2 from CH4. In this context, the working principles in terms of gas transport properties will be evaluated for three different systems. The discussion concerns: (1) poly(ether-b-amide) (PEBAX®1657)/polyacrylonitrile (PAN) composite hollow fibre membranes, (2) CO2-selective facilitated transport membranes, and (3) mixed matrix membranes based on Polymers of Intrinsic Microporosity (PIMs). The Pebax/PAN hollow fibre membranes were prepared by a new continuous coating method based on cross flow-filtration of a PEBAX solution. This allows simultaneous internal coating of a large number of the porous hollow fibres with a thin selective dense layer of PEBAX®, directly inside the module. The membrane preparation was optimized by modulating different parameters, such as coating time, polymer concentration and viscosity. The second approach discusses the potential use of ionic liquids as a vehicle for facilitated CO2 transport in membrane contactors for CO2/CH4 separation. The increase of the CO2 absorption in the ionic liquid [BMIM][OTf] by the use of the enzyme Carbonic Anhydrase (CA) was evaluated. The third approach analyzes the effect of Metal Organic Frameworks (MOFs) on the performance PIM-1 based mixed matrix membranes, provided by the School of Chemistry, University of Manchester (UK). Single gas permeation measurements were carried out to determine the gas separation performance of the membranes. In conclusion, the different types of membranes for CO2/CH4 separation will be compared, discussing the limitations and the advantages of all membranes and methods.
Effect of different formulations of magnesium chloride, used as anaesthetic agents, on the performance of the isolated heart of Octopus vulgaris
(2017-01-17) Pugliese, Chiara; Canonaco, Marcello; Gattuso, Alfonsina; Mazza, Rosa
Il cloruro di magnesio (MgCl2) rappresenta l'anestetico più comunemente utilizzato per i cefalopodi; tuttavia, i suoi effetti fisiologici compresi quelli a livello cardiaco non sono ben caratterizzati. Nel presente studio, utilizzando come modello sperimentale il polpo comune Octopus vulgaris, è stato valutato mediante la tecnica del cuore isolato e perfuso: a) se l'esposizione dell’animale in vivo (immersione) a diverse formulazioni di MgCl2 induce effetti sulla funzione cardiaca in vitro che potrebbero danneggiare il recupero dall'anestesia; b) l’effetto diretto della perfusione con diverse formulazioni di MgCl2 sulla funzione cardiaca. Per gli esperimenti in vivo, sono state utilizzate le seguenti formulazioni con relativi tempi di esposizione: i) MgCl2 3,5% in acqua di mare (MgCl2 sw, 20min); ii) MgCl2 3,5% (1:1, acqua di mare:acqua distillata, 20min); miscela di MgCl2 (1,12%) + etanolo (1%) (Mix, 20min e 45min); ipotermia (4°C, 5-10min). Alle condizioni basali, i cuori prelevati dopo esposizione ai vari trattamenti anestetici, inclusa l’ipotermia, sono stati in grado di lavorare con carichi emodinamici simili a quelli in vivo e di produrre valori fisiologici di gittata sistolica. In condizioni di carico emodinamico (incrementi di precarico), i cuori rimossi da animali esposti in vivo ad MgCl2 sw (20min) o al Mix (20min) hanno mostrato una performance cardiaca (in termini di risposta di Frank-Starling) comparabile a quella di animali anestetizzati mediante ipotermia. Al contrario, sia l'esposizione a MgCl2 (1:1, 20min), che al Mix (45min) ha mostrato un significativo deterioramento della risposta di Frank-Starling in termini di ridotta capacità di rispondere agli incrementi di precarico. Dopo esposizione ad ipotermia, la perfusione dei cuori isolati con concentrazioni crescenti delle diverse formulazioni di MgCl2, ha prodotto un effetto bradicardico dose-dipendente (e in alcuni casi arresto cardiaco) ed una riduzione della gittata cardiaca e del volume sistolico, indicativi di un effetto diretto dei trattamenti anestetici sul cuore. Al contrario, la perfusione con dosi crescenti di solo etanolo non ha causato alcuna variazione della frequenza cardiaca, indicando che l’effetto bradicardico evidenziato con la soluzione Mix è attribuibile al cloruro di magnesio. L'espressione di HSP70 e caspasi-3, e la fosforilazione di JNK e p38MAPK sono stati determinati in omogenati cardiaci, ottenuti da esemplari di O. vulgaris esposti alle diverse formulazioni di cloruro di magnesio o ad ipotermia (4°C). I risultati hanno evidenziato un incremento dell’espressione di HSP70 (ma non della caspasi-3); in particolare, l’espressione di HSP70 è risultata essere inferiore nei cuori prelevati da animali esposti ad ipotermia, rispetto a quelli esposti alle diverse formulazioni di MgCl2. Tra questi ultimi, nessuna differenza quantitativa è stata evidenziata tra le diverse formulazioni, ad eccezione del Mix 45min, effetto dovuto probabilmente al maggior tempo di esposizione. L'aumento della fosforilazione di JNK e p38MAPK, parallelo all'aumentata espressione di HSP70, lascia supporre il coinvolgimento di queste MAPKs nell'espressione di HSP70. Nell'insieme i dati dimostrano che, a condizione che l'esposizione in vivo al 3,5% di MgCl2 in acqua di mare o ad una miscela di MgCl2+etanolo sia limitato a ~ 20min, gli effetti residui sulla funzione cardiaca non influenzano il recupero post-anestesia. Inoltre, l’espressione di HSP70 che può giocare un ruolo citoprotettivo nella risposta allo stress durante l'anestesia, parallela alla mancata espressione della caspasi-3 in tutti i tessuti analizzati, permette di escludere eventi pro-apoptotici da parte di tutti i trattamenti anestetici. Nell’insieme questi risultati possono contribuire alla discussione circa le pratiche anestesiologiche da utilizzare anche in relazione all'applicazione della nuova Direttiva 2010/63 / UE per i cefalopodi.
Effetti del daidzein sul comportamento mnemonico attraverso le variazioni del sistema neurotensinergico e di fattori infiammatori in aree limbiche di criceti high fat diet
(2018-04-11) Fazzari, Gilda; Cerra, Maria Carmela; Canonaco, Marcello
In the past years, growing indications have pointed to food diets as major factors capable of conditioning physical-social states in humans as suggested by high-fat containing food sources which, despite their extremely "tasteful" properties, are responsible for marked morpho-structural alterations in critical brain areas for the regulation of not only psycho-cognitive behaviors but above all for nutritional parameters. It is already known that food consumption and action mechanisms implicated in energetic homeostasis are part of a complex neuronal circuit that when they are altered tend to account for increased body weight and consequently the development of obesity, regarded a chronic disease leading to different medical co-morbidities such as cardiovascular diseases (especially hypertension), dyslipidemia and diabetes type 2. From these effects plus the avoidance of applying drugs with numerous collateral alterations have directed a greater attention towards the production of "safer" drugs natural deriving vegetable extracts such as daidzein (DZ), a glucosidic isoflavone capable of mimicking estrogenic activities at the brain level, which supplied neuroprotective values against increased body weight, elevated feeding duration and diminished locomotor activity of high fat diet (HFD) hamsters (Mesocricetus auratus). This isoflavone also reduced anxiety-like behaviors in hyperlipidic animals as indicated by a greater time spent (p<0.01) in open arms of elevated plus maze (EPM) along with greater exploration (p<0.001) tendencies toward new objects of the novel object recognition (NOR) test. From a molecular point of view, DZ greatly protected the brain against neurodegeneration events as pointed out by few Amino Cupric Silver Stain granules in the hippocampus (HIP), hypothalamus (HTH) and amygdala (AMY) very likely via a diminished interaction of neurotensin receptor1 (anorexic neuropeptide; NTR1) GABAergic-leptin receptor levels in the latter two areas after the conditioned place preference (CPP) test. Contextually the recovered cognitive performances seemed to be tightly linked with reduced NTR1 expression levels in an ERβ manner for HIP after NOR test. In addition, such effects of DZ also strongly required increased levels of the antineuroinflammatory cytokine IL-10 that by reducing adenosine 5' monophosphate kinase (AMPK) and extracellular receptor kinase (ERK) widely improved cognitive together with exploratory behaviors. Overall, these first results supply important evidences on the neuroprotective values of DZ, which through NTR1 + IL-10 protective and repairing mechanisms of, aside the above limbic areas, also appetite-mediated brain centers known for their feeding, cognitive and endocrine functions, may surely comprise a good start for the introduction of novel therapeutic applications against obesity conditions.
Effetti neuro-comportamentali del rame nei teleostei: ruolo dell'HSP90 e del sistema ORXergico
(2012-11-29) Zizza, Merylin; Cerra, Maria Carmela; Canonaco, Marcello; Facciolo, Rosa Maria
Tra i metalli, il rame (Cu2+), sebbene essenziale per il corretto metabolismo corporeo, può risultare un potente agente tossico in grado di promuovere pericolosi eventi nocivi, soprattutto nei pesci. Ad oggi, sono poche le informazioni sulla neurotossicità ramedipendente e le risposte attivate per la difesa e riparazione da tale tossicità. Su questi presupposti, nel presente lavoro sono stati investigati gli effetti del cloruro di rame (CuCl2), a diverse concentrazioni e tempi di esposizione, sia a livello comportamentale che neuronale nel teleosteo d’acqua dolce, Carassius carassius, e marino, Thalassoma pavo. Da un punto di vista molecolare, l’attenzione è stata indirizzata alle variazioni trascrizionali dell’Heat Shock Protein 90 (HSP90), chaperon con ruolo critico sia in condizioni fisiologiche che di stress. Alla luce di recenti evidenze che propongono il sistema orexinergico come cruciale nella coordinazione delle reazioni fisiologiche allo stress, è stata valutata anche la capacità dell’orexina-A (ORX-A), somministrata ogni giorno intraperitonealmente (10 ng/g peso corporeo) durante l’esposizione al Cu2+, di modulare gli effetti neuro-comportamentali di tale metallo nei suddetti teleostei. Il trattamento a breve termine (48h) con due concentrazioni di metallo, selezionate mediante screening preliminari in Carassius carassius (1.45 mg/L e 0.30 mg/L CuCl2) e Thalassoma pavo (1.07 mg/L e 0.25 mg/L CuCl2), ha causato evidenti alterazioni comportamentali. In particolare, il feeding è risultato notevolmente (p<0.001; p<0.01) ridotto, vs i controlli, in Carassius carassius e in Thalassoma pavo, rispettivamente. Nel primo pesce, la concentrazione di 1.45 mg/L ha causato anche una moderata (p<0.05) riduzione dello swimming, accompagnata da un simultaneo incremento del resting state. In modo analogo, in Thalassoma pavo, la riduzione dello swimming durante l’esposizione alla più bassa concentrazione, si è tradotta in un concomitante incremento del resting state. Nei teleostei marini, esposti a 1.07 mg/L di metallo, l’assenza di effetti significativi sul rest era dovuta alla comparsa di abnormal motor behaviors, caratterizzati da perdita di equilibrio e movimenti repentini ed improvvisi. In Carassius carassius tali atteggiamenti insorgevano solo moderatamente dopo 48h di esposizione alla alta concentrazione. Inoltre, durante l’esposizione, entrambi i teleostei mostravano una considerevole tendenza a nuotare verso la superficie (swimming towards surface). Accanto agli effetti sul comportamento, l’Amino Cupric Silver Stain ha anche mostrato segni di neurodegenerazione a carico dei neuroni, soprattutto nel nucleo laterale del telencefalo dorsale (Dl) degli esemplari esposti alle alte concentrazioni di contaminante. Parallelamente, l’ibridazione in situ ha fatto registrare nell’encefalo di Thalassoma pavo, trattato con la concentrazione più alta, un’up-regulation dell’HSP90 in differenti nuclei, come Dl (+87%). In Carassius carassius la risposta trascrizionale è stata invece meno evidente, con moderati incrementi dell’mRNA rinvenuti, ad esempio, nella valvola del cervelletto (VCe; +31%), in seguito a trattamento con la più alta concentrazione che causava anche moderate down-regulations a livello del telencefalo. E’ stato interessante notare che molte delle alterazioni comportamentali venivano ridotte dalla somministrazione di ORX-A, soprattutto a livello del feeding di entrambi i teleostei. In Carassius carassius si è potuto osservare, inoltre, una riduzione degli abnormal motor behaviors e dello swimming towards surface. Anche a livello neurodegenerativo, l’ORX-A è stata in grado di prevenire i danni indotti dal Cu2+, come nel Dl di Carassius carassius esposto alla più alta concentrazione. Dal punto di vista molecolare, l’ORX-A ha prevenuto la down-regulation indotta dal metallo in Dl, favorendo addirittura una moderata up-regulation del trascritto in TLo (+32%) di Carassius carassius esposto a 1.45 mg/L di CuCl2, rispetto ai controlli. Anche in Thalassoma pavo, il neuropeptide induceva una significativa up-regulation dell’espressione di HSP90, come nel nucleo laterale del telencefalo ventrale (Vl; +92%) durante esposizione alla concentrazione più bassa di CuCl2. Quando i pesci esposti al Cu2+ per 48h sono stati trasferiti in acqua priva di metallo, molti deficit neuro-comportamentali erano, almeno parzialmente, ripristinati. Inoltre, quasi tutti i nuclei encefalici di entrambi i teleostei, esposti alla più alta concentrazione, hanno mostrato incrementi significativi dell’mRNA per l’HSP90, sia rispetto al precedente trattamento che ai controlli. Alla luce dei dati ottenuti e in virtù del fatto che la bassa concentrazione aveva fatto rinvenire alterazioni neuro-comportamentali più lievi, in alcuni casi recuperabili, è stato interessante verificare gli effetti di questa stessa concentrazione in un trattamento cronico (21 giorni). Nel corso di tale trattamento, il feeding di Carassius carassius era drasticamente ridotto, rispetto ai controlli, a partire dal giorno 7 di esposizione mentre in Thalassoma pavo la riduzione diveniva elevata al giorno 14. A livello encefalico, si riscontrava una più estesa degenerazione che colpiva molti più campi neuronali, compreso il nucleo diffuso del lobo inferiore (NDLI). Al contempo, il trattamento cronico era responsabile di una generalizzata up-regulation dell’HSP90 in Thalassoma pavo e di un effetto trascrizionale sito-specifico in Carassius carassius. In quest’ultimo teleosteo, infatti, si riportavano down-regulations nel telencefalo (~-30%) e in NDLI (-55%), ed upregulations in TLo (+30%), VCe (+43%) e nel corpo del cervelletto (CCe; +52%). La somministrazione di ORX-A al 21 giorno, sebbene causasse un’attenuazione degli effetti del Cu2+ sul comportamento, non era però capace di ridurre i danni neuronali e, a livello trascrizionale, non influenzava in modo efficiente l’espressione dell’HSP90 Nel complesso, i risultati di questo lavoro di Dottorato forniscono importanti evidenze degli effetti neuro-comportamentali del Cu2+ in Carassius carassius e Thalassoma pavo, sottolineando il coinvolgimento dell’HSP90 nei meccanismi di protezione e riparazione innescati a livello encefalico. In aggiunta a ciò, per la prima volta, si suggerisce l’implicazione del sistema ORXergico nell’attivazione di risposte adattative allo stress indotto dal Cu2+, sia nei teleostei marini che d’acqua dolce
I nitriti come molecola segnale: effetti diretti e indiretti sulla regolazione dell'attività cardiaca
(2012-11-20) Montesanti, Gabriella; Cerra, Maria Carmela; Canonaco, Marcello; Pellegrino, Daniela
Nitrite anion is a physiological NO storage form and an alternative way for NO generation, recently emerged as a cardioprotective endogenous modulator. Using Langendorff perfused rat hearts, as paradigms of mammals heart, we explored nitrite influence on the Frank-Starling response. We demonstrated that, like NO, exogenous nitrite improves the Frank-Starling response in rat heart as indicated by Left Ventricular Pressure (LVP) and the maximal rate of LVP decline (LVdP/dtmax), used as indexes of inotropism. Noteworthy, the minimal negative derivative of intraventricular pressure, LVdP/dt min, used as indexes of lusitropism, was positively affected by nitrite, suggesting the anion involvement not only in the systolic but also in the diastolic phase. This positive influence of nitrite was unaffected by endocardial endothelium impairment and NOS inhibition. In addition, the effect resulted sensitive to NO scavengers, independent on nitroxyl anion, and mediated by a cGMP/PKG-dependent pathway. These results suggest that nitrite acts as a physiological source of NO modulating the stretch-induced intrinsic regulation of the mammals heart. Moreover, nitrite affects numerous biological processes through NO-independent pathways (Bryan et al., 2005), including the S-nitrosylation of thiol-containing proteins (Foster et al., 2003). The mechanisms underlying these phenomena, until now not fully understood, are of great interest because of their cardiovascular therapeutic potential. In the last part of this study we analysed in the rat heart whether nitrite affect S-nitrosylation of cardiac proteins and the potential targets for S-nitrosylation. Rat hearts, perfused according to Langendorff, were exposed to nitrite and then analysed by Biotin Switch Method. We showed that nitrite increased the degree of S-nitrosylation of a broad range of membrane proteins. Further analysis, conducted on subfractioned proteins, allowed us to identify a high level of nitrosylation in a small range of plasmalemmal proteins (45-50 kDa). The increment in S-nitrosylation at this location was characterized by using an anti-Kir2.1 rabbit polyclonal antibody. We also verified that this effect of nitrite is preserved in the presence of the NO scavenger P-TIO. Finally, we wanted to investigate the direct effects of nitrite using two specific inhibitors of the major nitrite reductase in the heart, xantine oxidoreductase and citocrome P450 (allopurinol and ketoconazole respectively). The effect of nitrite in the presence of these inibitors is a bit reduced compared to control. A further analysis of this result, we used nitrite in the presence of N-acetyl-L-cysteine (NAC), a specific inhibitor of the nitroxyl anion (HNO). In this case, unlike that observed with the P-TIO, the effect of nitrite is significantly reduced. Our results suggest, for the first time, that nitrite represents a direct S-nitrosylating agent in cardiac tissues and that Kir2.1 channels are one of the targets. These observations are of relevance since they support the growing evidence that nitrite is not only a NO reserve but also a direct modulator of important functional cardiac proteins
<> catestatina migliora la risposta Frank-Starling in cuori di ratto normotesi e ipertesi agendo come attivatore fisiologico del pathway trasduzionale ossido nitrico-dipendente
(16-12-2015) Cantafio, Patrizia; Canonaco, Marcello; Angelone, Tommaso
The myocardial response to mechanical stretch (Frank-Starling law) is an important physiological cardiac determinant. Modulated by many endogenous substances, it is impaired in the presence of cardiovascular pathologies and during senescence. Catestatin (CST: hCgA352-372), a 21-amino-acid derivate of Chromogranin A (CgA), displays hypotensive/vasodilatory properties and counteracts excessive systemic and/or intra-cardiac excitatory stimuli (e.g., catecholamines and endothelin-1). CST, produced also by the myocardium, affects the heart by modulating inotropy, lusitropy and the coronary tone through a Nitric Oxide (NO)-dependent mechanism. This study evaluated the putative influence elicited by CST on the Frank-Starling response of normotensive Wistar Kyoto (WKY) and hypertensive (SHR) hearts by using isolated and Langendorff perfused cardiac preparations. Functional changes were evaluated on aged (18-month-old) WKY rats and SHR which mimic human chronic heart failure (HF). Comparison to WKY rats, SHR showed a reduced Frank-Starling response. In both rat strains, CST administration improved myocardial mechanical response to increased end-diastolic pressures. This effect was mediated by EE/IP3K/NOS/NO/cGMP/PKG, as revealed by specific inhibitors. CST-dependent positive Frank-Starling response is paralleled by an increment in protein S-Nitrosylation, AKT/eNOS/nNOS and PLN phosphorylations. Our data suggested CST as a NO dependent physiological modulator of the stretch-induced intrinsic regulation of the heart. This may be of particular importance in the aged hypertrophic heart, whose function is impaired because of a reduced systolic performance accompanied by delayed relaxation and increased diastolic stiffness.
Identification of Pseudo‐nitzschia (Bacillariophyceae) species using Whole Cell‐Fluorescent In Situ Hybridization (WC-FISH): from cultured sample to field test
(2013-12-02) Ruffolo, Ruffolo; Canonaco, Marcello; Cozza, Radiana
Il ruolo della Cromogranina A e dei suoi peptidi derivati, Serpinina e Catestatina, nella fisiopatologia cardiaca
(2012-11-24) Gentile, Stefano; Cerra, Maria Carmela; Angelone, Tommaso; Canonaco, Marcello
Il ruolo cardiovascolare della CgA e dei suoi peptidi bioattivi è stato ampiamente documentato. I livelli plasmatici di CgA (range fisiologico da 0.5nM a 5nM), inizialmente utilizzati nella pratica clinica come biomarker di tumori neuroendocrini (O’Connor and Bernstein, 1984; Stridsberg and Husebye, 1997), rappresentano anche un importante marker per le disfunzioni del sistema cardiocircolatorio come ad esempio l’ipertensione essenziale, le cardiomiopatie ipertrofico/dilatative e l’insufficienza cardiaca (Ceconi et al., 2002). Recentemente Jansson et al. (2009), e Rosjo et al. (2010), hanno dimostrato che i livelli di CgA nella sindrome coronarica acuta forniscono informazioni prognostiche indipendentemente dagli altri markers di rischio convenzionali. L’importanza della CgA nella biologia cardiaca è inoltre supportata dall’osservazione che la delezione del gene per la CgA nei topi provoca lo sviluppo di ipertensione, che può essere riportata a livelli fisiologici trattando gli animali con CST o reintroducendo il gene per la CgA in topi con background Chga-/- (Mahapatra et al., 2005). I livelli plasmatici di CgA aumentano in condizioni di eccessiva stimolazione del sistema simpatico, particolarmente evidente nell’insufficienza cardiaca. Ceconi et al. (2002) e Pieroni et al. (2007), hanno dimostrato che in pazienti affetti da insufficienza cardiaca le concentrazioni plasmatiche di CgA sono aumentate (10-20 nM; 500-1000ng/ml), e strettamente correlate alla severità della patologia. Al momento non sono però disponibili informazioni sugli effetti diretti della CgA intera sul cuore, e sui fattori che regolano la sua produzione e processamento a livello miocardico.Il presente lavoro ha quindi lo scopo di chiarire se, e in che misura, la CgA intera induce effetti diretti sulla performance cardiaca, e la possibilità di un processamento proteolitico intracardiaco stimolo-dipendente della proteina. Utilizzando ratti normotesi (WKY) e ipertesi (SHR), abbiamo valutato i) gli effetti miocardici e coronarici della CgA intera nel cuore di ratto isolato e perfuso secondo metodica Langendorff; ii) il pathway trasduzionale (Akt/NOS/NO/cGMP/PKG) coinvolto nel suo meccanismo d’azione; iii) il processamento intracardiaco della CgA in seguito a stimolazione -adrenergica con ISO. Dal processamento della CgA deriva una serie di peptidi bioattivi; fra questi i peptidi N-terminali VS-1/2, (VS-1 CgA1-76; VS-2 CgA1-113), e il peptide C-terminale CST (CgA352-372), hanno effetti cardioattivi. La CST promuove l’angiogenesi (Theurl et al., 2010), abbassa la pressione sanguigna (Mahapatra et al., 2005; Fung et al., 2010; Gaede and Pilowsky, 2012), riduce la contrattilità cardiaca (Angelone et al., 2008; Mazza et al., 2008; Imbrogno et al., 2010), e incrementa la sensibilità dei barocettori (Gayen et al., 2009a; Gaede and Pilowsky, 2010). Recentemente è stato scoperto un nuovo frammento derivato dalla CgA. A livello della regione C-terminale, altamente conservata, il clivaggio proteico ad opera delle pro-ormone convertasi (PC1/2/3), genera un frammento di 2.9 kDa, la “serpinina” (Ala26Leu), il quale può subire una modificazione all’estremità N-terminale per formare un residuo di piro-glutammato (pGlu23Leu o pGlu-serpinina) (Koshimizu et al., 2011a,b). La presenza di entrambe le forme di serpinina è stata rilevata in colture di cellule di ghiandola pituitaria (AtT20). Questi peptidi sono in grado di inibire la morte cellulare indotta da stress ossidativo (Koshimizu et al., 2011a), e di promuovere la biogenesi dei granuli secretori nelle cellule endocrine regolando l’espressione di un inibitore delle proteasi, la proteasi nexina-1 (PN-1), che previene la degradazione delle proteine dei granuli nell’apparato di Golgi. È stato osservato che i peptidi della serpinina agiscono attraverso il pathway AC/cAMP/PKA (Koshimizu et al., 2011b), suggerendo che il meccanismo eccitatorio indotto dalla serpinina potrebbe controbilanciare gli effetti antiadrenergici e cardioinibitori indotti dalla CST e VS-1. Ad oggi non esistono evidenze sperimentali sul possibile ruolo cardioattivo della serpinina; pertanto nel presente lavoro di tesi è stata valutata la presenza di questo peptide e delle sue forme alternative nel cuore di ratto; è stato inoltre osservato in che modo influenzano la performance miocardica e la vasoattività coronarica. La serpinina e la pGlu-serpinina inducono un effetto positivo dose-dipendente sulla contrazione (inotropismo) del cuore di ratto isolato e perfuso secondo metodica Langendorff e sui muscoli papillari isolati, nonché sul rilassamento (lusitropismo) miocardico. Questi effetti miocardici sono stati accompagnati da una lieve, ma non significativa, vasodilatazione coronarica. Un terzo peptide, la serpinina Ala29Gly, non ha influenzato la performance cardiaca a nessuna delle concentrazioni testate. Sia la serpinina che la pGlu-serpinina sembrano agire attraverso il pathway 1-AR/AC/cAMP/PKA. Questi dati evidenziano le proprietà cardio-circolatorie della serpinina e della pGlu-serpinina, fornendo ulteriori informazioni su come i peptidi CgA derivati possano, controbilanciandosi, regolare finemente l’attività cardiaca in risposta a stimoli -adrenergici.Il quadro clinico dei pazienti affetti da cardiopatie è complicato da un’altra patologia che si accompagna spesso alle cardiopatie, la sindrome metabolica. E’ stato constatato, infatti, che circa il 30% di pazienti con cardiopatia ischemica acuta sono affetti da sindrome metabolica (ad esempio diabete, obesità). Il peptide CgA derivato prancreastatina (CgA250-301, PST) (Tatemoto et al., 1986; O’Connor et al., 2005; Gayen et al., 2009b), svolge diverse funzioni a livello metabolico, in particolare sul metabolismo del glucosio (Tatemoto et al., 1986). Tuttavia non sembra avere effetti a livello cardiovascolare. Studi recenti hanno evidenziato il ruolo della PST e della CST nel regolare la secrezione di insulina mantenendo l’omeostasi fra l’effetto anti-insulina della PST, e gli effetti insulino-sensitizzante della CST. (Gayen et al., 2009b). È stata valutata la possibile azione della CST sul metabolismo lipidico che, come è ben noto, risulta alterato nei soggetti obesi. Le cellule adipose sono regolate dalle catecolamine attraverso quattro tipi di AR: 1, 2, 3 e 2 (Arner, 1999; Arner, 2005). L’attivazione dei recettori -AR, coinvolgento le proteine G stimolatorie, aumenta la produzione di cAMP; questo a sua volta attiva la PKA, la quale fosforila la lipasi ormone sensibile (HSL) causando l’idrolisi dei lipidi. Al contrario, l’attivazione dei recettori 2-AR, accoppiati a proteine G inibitorie, inducono effetti opposti sulla lipolisi (Lafontan et al., 1997; Stich et al., 1999, 2003; Lafontan and Langin, 2009). Pertanto l’azione netta delle catecolamine sulla lipolisi dipende dall’equilibrio fra recettori - e -AR (Arner, 2005). Normalmente l’azione lipolitica indotta dai recettori -AR prevale sull’azione -AR. Una continua stimolazione del sistema nervoso simpatico o un aumento delle catecolamine plasmatiche, è spesso associato alla desensitizzazione dei -AR (Mori et al., 2007). Studi in vivo hanno dimostrato che l’azione lipolitica delle catecolamine è ridotta nei soggetti obesi (Bougneres et al., 1997; Jensen, 1997). Il trattamento ripetuto con epinefrina induce soppressione della lipolisi, basale e indotta da epinefrina, sia in soggetti normopeso che obesi (Townsend et al., 1994). Anche negli studi in vitro la risposta lipolitica indotta dall’epinefrina è diminuita dal pretrattamento con la stessa molecola (Stallknecht et al., 1997). Sulla base di questi dati, è stato ipotizzato che l’aumentata massa adiposa dei topi iperadrenergici Chga-KO (Gayen et al., 2009a) possa rispecchiare la desensitizzazione dovuta all’aumento delle catecolamine circolanti (Mahapatra et al., 2005). I topi Chga-KO mostrano, nonostante gli elevati livelli circolanti di catecolamine e leptina, una notevole adiposità. Le catecolamine inibiscono la secrezione della leptina (Fritsche et al., 1998; Scriba et al., 2000; Couillard et al., 2002); la desensitizzazione del -AR potrebbe prevenire tale effetto, causando un aumento dei livelli di leptina e della massa adiposa, così come mostrato nei topi Chga-KO e in altri modelli sperimentali di obesità. Come osservato nei topi DIO (diet induced obesity), l’aumento di leptina circolante induce la desensitizzazione dei recettori per la leptina, possibile causa del fenotipo obeso dei topi Chga-KO. Sulla base di queste osservazioni, è stato ipotizzato che la CST possa ridurre l’obesità ripristinando la sensibilità dei recettori adrenergici e dei recettori per la leptina attraverso la normalizzazione dei livelli plasmatici di catecolamine e leptina. È stato infatti osservato che il trattamento cronico con CST induce una significativa riduzione della massa adiposa nei topi Chga-KO. Il trattamento con CST ha inoltre determinato una riduzione del peso corporeo e della massa adiposa anche nei topi DIO, senza alterare l’assunzione di cibo. Sia nei topi DIO che nei topi ob/ob, in cui l’obesità è dovuta all’incapacità di produrre leptina, la CST è in grado di incrementare gli effetti della leptina sul metabolismo e sul signaling del tessuto adiposo. Le nostre osservazioni suggeriscono che la riduzione della massa grassa dopo trattamento cronico con CST è dovuta ad un aumento della lipolisi e della mobilizzazione dei lipidi; inoltre sembra che la CST agisca attraverso i recettori 2-AR e i recettori per la leptina. In linea con tali osservazioni, la CST promuove l’ossidazione degli acidi grassi e il signaling della leptina.
<> ruolo del GPER nelle arterie uterine e mesenteriche in gravidanza
(2015-12-16) Tropea, Teresa; Canonaco, Marcello; Mandalà, Maurizio
Low uteroplacental blood flow has been implicated as a cause of pregnancy hypertension and intrauterine fetal growth retardation. A successful pregnancy outcome requires a sufficient uteroplacental blood flow, which increases of many fold compared to the non pregnant levels. This significant increase is achieved in part by vasodilation of the uterine vasculature because pregnancy induces a physiological remodelling of the maternal uterine circulation. Estrogen may contribute to this effect although the mechanisms involved remain unclear. It is known that estrogen receptor-α and estrogen receptor-β in the uterine vascular endothelium are both functionally implicated in the regulation of the uterine blood flow but so far nothing is known about the novel G-protein coupled estrogen receptor (GPER) in the uterine vasculature. GPER has been identified in many vascular bed exerting its potential vasorelaxing effect. The aim of this study was to investigate the function of GPER in the regulation of the uterine vascular tone during pregnancy. Experiments were carried out on mesenteric arterioles and uterine radial arteries isolated from both non-pregnant (NP) and age-matched pregnant (P) Sprague Dawley rats to compare reproductive and systemic vasculature effect. Arterial segments were pressurized to 50 mmHg in the pressure myography, preconstricted of 40% with phenylephrine and then incubated with incremental doses (10-12-10-6 M) of the specific GPER agonist, G-1. A dose-response curve was obtained for G-1 in the 1 pM – 1 μM range with a maximum vasodilation of uterine arteries of 97,8 ± 2,5% in P vs 66,5 ± 3,7% in NP, p<0.001. G-1 vasorelaxing effect was similar in pregnant (45,5 ± 6,1%) and non-pregnant (53,6 ± 2,3%) mesenteric arteries. Pregnancy induced a significantly higher G-1 vasodilation only in uterine artery and its protein expression was also increased. G-1 effect was significantly reduced by the GPER antagonist, G-15. The NOS inhibitors, L-NAME+L-NNA or endothelium removal reduced the G-1 induced relaxation of uterine artery, suggesting an endothelium-dependent mechanism, involving cGMP pathway but not BKca channels. Immunohistochemistry revealed the GPER expression in the main uterine artery of both eNOS-/- and wild type pregnant mice. This receptor was functionally activated in a dose response manner with a significant less effect in knock out mice, showing the relevance of the NO in GPER pathway. GPER is also present in human chorionic plate arteries and its activation induces a slight vasodilation. These results demonstrate for the first time that GPER may have a role in regulating vascular tone, placental perfusion and normal fetal development, suggesting a potential therapeutic target in pregnant diseases.
Impatto sull'antropodofauna di prodotti ammessi contro la bactrocera oleae (Rossi, 1790) in olivicoltura biologia)
(2013-05-07) Belfiore, Tiziana; Brandmayr, Pietro; Canonaco, Marcello
Implementazione di sistemi innovativi per la qualità e tracciabilità di “Healthy Food”
(2017-07-03) Macchione, Claudia; De Cindio, Bruno; Canonaco, Marcello
Innovativi multiclassificatori con applicazione ai sistemi di supporto alle decisioni cliniche
(2017-07-03) Groccia, Maria Carmela; Conforti, Domenico; Canonaco, Marcello
Interazione tra Catestatina e fibre Orexinergiche/NMDAergiche in condizioni simil-ischemiche nel criceto ibernante
(2014-11-11) Mele, Maria; Canonaco, Marcello; Cerra, Maria Carmela
L‘ischemia cerebrale rappresenta la principale causa di mortalità e morbidità a livello mondiale, provocando spesso deficit motori e riducendo la qualità della vita. Ciò è dovuto al fatto che la carenza di ossigeno e glucosio causa gravi danni al Sistema Nervoso Centrale. Sono diversi i sistemi neuronali implicati nella patogenesi ischemica, tra questi rivestono particolare importanza quello orexinergico (ORXRs), i recettori N-metil-D-aspartato (NMDAR) e la catestatina (CST). Alla luce di quanto detto, l‘obiettivo di questo lavoro è valutare gli effetti, sui sistemi recettoriali suddetti, causati dagli insulti ischemici sia attraverso un approccio in vivo, sia attraverso una simulazione dell‘ischemia in vitro. Nel primo caso, criceti ibernanati (Mesocricetus auratus) sono stati infusi con CST, ORX-A o ORX-A+CST, a livello del nucleo periventricolare ipotalamico, scelto per la sua implicazione nel controllo cardiovascolare, del feeding e del ciclo sonno/veglia, dopodiché è stata correlata l‘espressione del ORX2R e dei vari parametri del feeding. Dai risultati è emerso che la CST determina un effetto anoressigenico attraverso la down-regulation del ORX2R soprattutto nei nuclei implicati nel controllo del feeding, mentre l‘ORX-A causa l‘effetto opposto. Nella seconda parte la condizione ischemica è stata simulata attraverso la deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD) in cellule ippocampali (HIP) e ipotalamiche (HTH), con successiva valutazione degli effetti trascrizionali indotti dalla CST. Sorprendetemente, i due tipi cellulari rispondono in modo diverso all‘insulto ischemico quando posti insieme in coltura, rispetto alle cellule cresciute separatamente. Infatti, l‘aggiunta della CST in HIP OGD causa una down-regulation della subunità NMDAergica NR2A e un up-regulation di NR1 e ORX1R, recettore quest‘ultimo, che invece è ampiamente espresso in presenza di cellule HTH. In quest‘ultime, invece, la CST provoca la down-regulation di tutti i fattori analizzati, ma tale trend viene completamente invertito in presenza di cellule HIP. In conclusione dai risultati ottenuti sembra che la CST sia in grado di determinare variazioni dell‘espressione NMDAergica e ORXergica, e ciò potrebbe proporre nuovi scenari per il ruolo neuronale di tali recettori e della CST nella patogenesi ischemica.
Investigating how movement affects prey camouflage using an insect predator
(2019-06-09) Umeton, Diana; Canonaco, Marcello; Brandmayr, Pietro
Patterns that help prey camouflage themselves whilst stationary prove to be ineffective once prey move. Given that motion breaks camouflage, can a moving prey ever be effectively concealed? Recent studies have found that certain patterns might help prey deceive their predators whilst moving, as in the case of ‘motion dazzle’. However, research with moving prey has been conducted using only humans or birds as predator models, and consequently, it is now known how other predator species might behave. In addition, it is important to know not just how motion affects camouflage, but also how the speed of motion can affect the efficacy of different defensive patterns. This thesis aims to address these current gaps in the field. First, I explore the visual acuity in a group of insect predators, the praying mantids, to explore if different species vary in their visual acuity, which could impact on what they can perceive and which selective pressure they could exert on prey defensive patterns. Second, using praying mantids tracking computer-generated stimuli, I empirically investigate how cryptic and conspicuous patterns might enhance the survival of moving prey. In particular, I specifically investigate if high contrast striped prey could reduce predation risk through the visual phenomenon known as “flicker fusion effect”. I found that when prey were slow moving, all patterns were equally detectable by the mantids. However, once prey moved at faster speed, a cryptic pattern was more likely to be tracked than a more conspicuous black-and-white striped pattern suggesting that the latter was successful in inducing flicker fusion effect in praying mantids’ eyes. This thesis starts to disentangle how pattern and speed could combine to help camouflage an animal when moving through its environment. The outcome of the study are discussed in the wider context of how animals coloration and behaviour evolved together to confer them survival advantages.