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Bisphenol A induces gene expression changes an proliferative effects through GPER in breast cancer celles and cancer-associated fibroblasts
(2012) Pupo, Marco; Maggiolini, Marcello; Sisci, Diego
Bisphenol A (BPA) is the principal constituent of baby bottles, reusable water bottles, metal cans, and plastic food containers. BPA exerts estrogen-like activity by interacting with the classical estrogen receptors (ER and ER ) and through the G protein-coupled receptor (GPR30/GPER). In this regard, recent studies have shown that GPER was involved in the proliferative effects induced by BPA in both normal and tumor cells. In this study we evaluated the transduction pathways through which BPA influences cell proliferation and migration in human breast cancer cells and cancer-associated fibroblasts (CAFs), that lack the classical ERs. Specific pharmacological inhibitors and gene-silencing procedures showed that BPA induces the expression of the GPER target genes c􀌻FOS, EGR􀌻1, and CTGF through the GPER/EGFR/ERK transduction signaling in SKBR3 breast cancer cells and CAFs. Moreover, we observed that GPER is required for growth effects and migration stimulated by BPA in both cell types. Our results indicate that GPER is involved in the biological action elicited by BPA in breast cancer cells and CAFs. Hence, GPER-mediated signaling should be included among the transduction mechanisms through which BPA may stimulate cancer progression
Caratterizzazione biochimico funzionale di una sottofamiglia proteica di Drosophila melanogaster correlata al trasportatore mitocondriale umano di acidi dicarbossilici
(2014-05-22) Mazzeo, Giancarlo; Dolce, Vincenza; Sisci, Diego
Caratterizzazione del ruolo dell'autofagia in un modello sperimentale di glaucoma acuto
(2011) Varano, Giuseppe Pasquale; Sisci, Diego; Russo, Rossella
Il termine glaucoma indica un gruppo eterogeneo di neuropatie ottiche progressive caratterizzate da alterazioni del campo visivo dovute alla morte delle cellule ganglionari retiniche (Retinal Ganglion Cells, RGCs) e alla degenerazione del nervo ottico. Le strutture interessate in corso di glaucoma, retina e nervo ottico, costituiscono parte del sistema nervoso centrale (SNC), pertanto, il glaucoma è considerato, sotto ogni aspetto, una malattia neurodegenerativa. Così come per molte altre patologie neurodegenerative, l’eziologia del glaucoma è complessa e multifattoriale e la fisiopatologia cellulare e molecolare rimane poco sconosciuta. L’aumento della pressione intraoculare è considerato il principale fattore di rischio associato alla patologia, sebbene non sia la condizione necessaria e sufficiente per l'insorgenza della malattia e le cause responsabili della morte delle cellule ganglionari retiniche rimangono ancora ignote. Tuttavia, diversi sono i fattori che possono essere coinvolti per spiegare la perdita delle cellule ganglionari retiniche, fra questi: la deprivazione di fattori trofici, il danno da ischemia-riperfusione, lo stress ossidativo, la disfunzione mitocondriale e l’eccitotossicità indotta dal glutammato. Il processo autofagico rappresenta il principale sistema di degradazione lisosomiale per il turnover di organelli e di proteine a lunga emivita. Questo processo permette alla cellula di eliminare componenti tossici o danneggiati allo scopo di mantenere i livelli energetici e l’omeostasi cellulare in condizioni di stress metabolico. Un crescente numero di evidenze sperimentali suggerisce che la disfunzione o la deregolazione autofagica è associata a diverse patologie neurodegenerative di tipo cronico, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington, ma anche di tipo acuto, come il danno ipossico e ischemico. Tuttavia, nonostante i numerosi studi sul ruolo dell’autofagia nelle malattie neurodegenerative, il ruolo di tale processo nella degenerazione retinica rimane ancora poco studiato. Pertanto, gli obiettivi del presente lavoro di ricerca sono stati: - verificare la modulazione del processo autofagico in un modello sperimentale di glaucoma in vivo ottenuto attraverso l’aumento transitorio della pressione intraoculare con conseguente ischemia retinica. - valutare il ruolo dell’autofagia sulla vitalità cellulare in colture di cellule ganglionari retiniche RGC-5 attraverso la manipolazione farmacologica ed il silenziamento genico di proteine tipicamente coinvolte nel processo autofagico I risultati ottenuti dimostrano che l’insulto ischemico induce una riduzione significativa dell’espressione della forma associata all’autofagosoma della proteina LC3 (LC3II) e della proteina Beclin-1, coinvolta nelle fasi iniziali del processo autofagico. Quest’ultimo evento è accompagnato dal clivaggio proteolitico della proteina Beclin-1 nella fase post-ischemica con accumulo di un frammento proteico di 50kDa. L’attivazione della cascata eccitotossica, che consegue all’eccessiva stimolazione dei recettori NMDA per il glutammato, caratterizza l’insulto ischemico retinico e la morte delle cellule ganglionari ad esso associata. Nel presente lavoro è stata studiata l’attivazione delle proteasi Ca2+-dipendenti calpaine, tipicamente associate al fenomeno eccitotossico, in seguito all’induzione dell’ischemia retinica. Il profilo temporale di attivazione di questi enzimi proteolitici mostra un andamento compatibile con un loro coinvolgimento nel clivaggio della proteina Beclin-1. Il trattamento con l’antagonista non competitivo dei recettori NMDA del glutammato, l’MK- 801 (50nM, 5μl/occhio), con gli inibitori delle calpaine MDL28170 ed SJA6017 (1mM, 3μl/occhio) ed il silenziamento genico della subunità-1 delle calpaine in vivo (CAPNS1- siRNA, 10μg/occhio), mentre riducono l’attività delle proteasi, prevengono l’accumulo del frammento di 50kDa. L’insieme dei dati conferma il coinvolgimento delle calpaine nel clivaggio di Beclin-1, che viene pertanto identificata come un nuovo substrato di queste proteasi. Infine, il ruolo protettivo o detrimentale dell’autofagia è stato valutato in colture cellulari RGC-5 in vitro. La deprivazione da siero per un periodo di 24h induce l’attivazione dell’autofagia; il trattamento con gli inibitori del processo autofagico, Bafilomicina-A1 (100nM) e 3-metil-adenina (10mM), ed il silenziamento genico della proteina Beclin-1 in vitro riducono in modo significativo la vitalità delle RGC-5 in condizioni di deprivazione da siero. In conclusione, i dati riportati in questo studio indicano una deregolazione dell’autofagia in seguito all’ischemia/riperfusione retinica associata al clivaggio, mediato dalle calpaine, della proteina Beclin-1 e supportano il ruolo neuroprotettivo di questo processo nelle cellule ganglionari retiniche. Pertanto, la regolazione del processo autofagico potrebbe rappresentare un aspetto importante nelle patologie oculari associate ad eventi ischemici e quindi un potenziale bersaglio per nuove strategie neuroprotettive.
Caratterizzazione pre-clinica di una nuova strategia terapeutica per l'ischemia cerebrale identificata mediante drug repurposing di un antibiotico macrolide
(2013-11-30) Certo, Michelangelo; Amantea, Diana; Sisci, Diego
Cerebral ischemia is one of the most common causes of disability and mortality worldwide and the only pharmacological treatment currently available is thrombolysis. The understanding of the mechanisms underlying ischemic injury has led to the identification of several neuroprotective compounds aimed at the recovery of the damaged brain tissue. However, most of these drugs have produced disappointing results in clinical trials because of the high toxicity or lack of efficacy in patients. Therefore, there is a real need to develop novel therapeutic strategies that do not consider neurons as the only target. In fact, the neuronal damage is strongly influenced by the inflammatory and immune processes that develop both locally and systemically after ischemia. The inflammatory response evolves slowly, and this allows to significantly expand the time window for pharmacological intervention, highlighting the therapeutic potential of anti-inflammatory and immunomodulatory drugs. Therefore, the first objective of this work was to characterize central and peripheral inflammatory responses that occur following an ischemic insult in rodents. In particular, in order to identify potential targets, we have evaluated the temporal profile of activation of specific inflammatory cells. By immunofluorescence analysis, we observed an early activation of microglia and astrocytes in the ischemic hemisphere, as a result of transient middle cerebral artery occlusion (MCAo) in rodents. We have also detected a massive brain recruitment of neutrophils and macrophages, with a peak of infiltration 48 hours after the insult, whereas T lymphocytes have been identified only at later times. Together with evidence from microarray studies demonstrating that the majority of genes modulated acutely in the blood of stroke patients resides in neutrophils and monocytes, our findings suggest that these cells may be useful therapeutic targets. Using the repurposing approach we have selected a drug, azithromycin, that is able to modulate the functions of macrophages and neutrophils in pathological conditions other than ischemia. Pre-treatment with azithromycin (150 mg/kg, orally) produces a significant reduction of the cerebral infarct volume induced by transient or permanent MCAo in rats. This suggests a potential prophylactic use of the drug during surgical procedures associated to a high risk of ischemic tissue damage. We have also observed the neuroprotective activity of azithromycin when the drug is administered systemically after a transient ischemic insult. The reduction of the infarct volume induced by transient MCAo is dose-dependent (ED50 = 0.59 mg/kg in mice, ED50 = 1.19 mg/kg in rats) and is approximately 60% (compared to vehicle) with the most effective dose of azithromycin (150 mg/kg, i.p.). The neuroprotective doses in rodents are therefore much lower than the antibiotic ones. We have also documented that the reduction of the infarct volume and the improvement of the neurological deficit due to azithromycin post-treatment (150 mg/kg, ip) are maintained up to 7 days after the insult. Furthermore, the time window of efficacy is rather wide, since neuroprotection is observed with the drug administered up to 6 hours after the insult both in rats and in mice subjected to transient MCAo. The characterization of the neuroprotective effects of azithromycin, demonstrated by the present study in models of focal ischemia in rodents, provides the basis for the validation of the drug efficacy in patients suffering from ischemic stroke.
Characterization of the role of ageing on mechanical and thermal nociception and nocifensive response to formalin test in C57BL/6 Mice
(2014-10-27) Scuteri, Damiana; Sisci, Diego; Berliocchi, Laura
Il dolore cronico, che riduce notevolmente la qualità della vita, interessa un vasto segmento della popolazione globale (il 25% della popolazione Europea e più di 100 milioni di cittadini Americani), diventando anche più frequente negli anziani (> 65 anni). In questa popolazione, il dolore cronico spesso viene incompreso e non opportunamente trattato (Bruckenthal & D’Arcy, 2007), anche a causa della resistenza alla maggior parte degli analgesici di elezione. Pertanto, questo progetto di dottorato è stato condotto con l’obiettivo di caratterizzare un modello di dolore cronico che potesse essere un valido strumento rappresentativo della condizione di dolore cronico nell’anziano ed il ruolo dell’invecchiamento nella nocicezione meccanica e termica e nella risposta nocifensiva in topi C57BL/6. Topi C57BL/6 di due mesi di età sono stati sottoposti al Test della Formalina (Dubuisson & Dennis, 1977): oltre a studiare il comportamento nocifensivo di licking/biting/flinching indotto dalla formalina, l’allodinia meccanica e l’edema sviluppati dagli animali in seguito alla somministrazione di formalina sono stati rispettivamente investigati tramite il Test di Von Frey (Chaplan et al., 1994) e l’utilizzo di un calibro, nel 1°, 4°, 7°, 9°, 11° e 14° giorno successivo alla somministrazione di formalina. Inoltre, è stata studiata l’efficacia del gabapentin, uno dei trattamenti di scelta per gli stati di dolore cronico come la neuropatia diabetica e la nevralgia postherpetica (Backonja et al., 1998; Rowbotham et al., 1998), sia nella risposta nocifensiva al test della formalina sia nella conseguente allodinia meccanica, fino a 4 giorni dopo l’iniezione di formalina. I risultati ottenuti hanno dimostrato la presenza di allodinia meccanica nella zampa ipsilaterale già due ore dopo la somministrazione di formalina, con il picco nel 4° giorno. Questa allodinia meccanica a lungo termine (fino a 14 giorni), nel 4° giorno successivo all’iniezione di formalina, interessa anche la zampa controlaterale, confermando l’esistenza di meccanismi centrali ritenuti alla base della seconda fase del test della formalina ed escludendo la possibilità che tale allodinia possa essere causata dall’edema evidenziato. Il gabapentin è risultato molto efficace nella seconda fase, lievemente efficace nella prima fase e nell’allodinia meccanica indotta dalla formalina 2 ore dopo la somministrazione di formalina. Tale attività non è stata evidenziata nel primo e nel quarto giorno successivo all’iniezione di formalina, verosimilmente a causa dell’emivita del farmaco. I nostri risultati caratterizzano il test della formalin come un modello rappresentativo di uno stato di dolore cronico che racchiude sia le caratteristiche infiammatorie del dolore articolare, spesso resistente al trattamento (Scaglione et al., 2014), sia gli aspetti centrali del dolore neuropatico, perciò molto utile per studiare le condizioni di dolore cronico che affliggono un crescente numero di pazienti anziani. Inoltre, il quadro fisiopatologico del dolore nell’anziano è stato approfondito per comprendere come l’invecchiamento potesse influenzare prima la nocicezione e, successivamente, lo sviluppo ed il mantenimento del dolore, dal momento che i cambiamenti nella nocicezione indotti dall’età non sono ancora ben noti (Taguchi et al., 2010). Pertanto, topi C57BL/6 giovani (2 mesi) e più anziani (6, 12 e 18 mesi) sono stati sottoposti a test comportamentali per determinare la sensibilità basale meccanica e termica (test di Von Frey (Chaplan et al., 1994), Pin-prick test (Chan et al., 1992), test di Hargreaves (Hargreaves et al., 1988), test dell’acetone (Choi et al., 1994)). Come dimostrato anche da studi longitudinali, soprattutto la sensibilità meccanica ed anche quella termica (sia al caldo che al freddo) sono risultate incrementate. I primi cambiamenti evidenti, in particolare per la sensibilità al freddo, sono stati osservati intorno ai 6 mesi di età. Fra l’età di 12 e di 18 mesi, i livelli di sensibilità hanno mostrato una sorta di plateau, con un incremento molto più lento. Poiché la nocicezione è risultata essere modificata negli animali anziani, si è deciso di esaminare l’effetto dell’età sulla risposta nocifensiva al dolore evocato (test della formalina). La risposta nocicettiva, espressa in secondi di licking/biting/flinching e come totale di eventi di licking/biting/flinching, è risultata differente nei topi anziani (6, 12, 18 mesi), presentando non più solo 2 ma 3 fasi di picco, uno spostamento temporale ed un’ampiezza variata. Inoltre, lo stato allodinico formalina-indotto è risultato più pronunciato nei topi anziani, nei quali l’allodinia meccanica ha continuato ancora a rimanere stabile al picco, mentre nei topi di due mesi il recupero stava già cominciando. Anche il processo di guarigione e l’edema della zampa sono risultati influenzati dall’età dell’animale. A livello molecolare, non sono state evidenziate differenze significative nei livelli della proteina p62, di LC3- I e di LC3-II, mentre solo i livelli di espressione di Beclin 1 sono risultati progressivamente ridotti con l’invecchiamento, in maniera statisticamente significativa. Sebbene siano necessari ulteriori esperimenti, questi risultati sembrano suggerire che la pathway dell’autofagia sia modificata e che il flusso autofagico sia probabilmente ridotto. Di fondamentale importanza è l’osservazione che il principale marker di dolore cronico, la subunità del canale del Ca2+ α2δ-1, è risultata quasi assente nei topi di 2 mesi e notevolmente up-regolata, seguendo un andamento a campana, nei topi di 6 e di 12 mesi. Questo fenomeno potrebbe essere alla base della ridotta soglia meccanica dei topi più anziani. Inoltre, una nuova banda a basso peso molecolare, che abbiamo chiamato α2δ-1*, è risultata altamente presente nei topi più anziani rispetto ai topi di due mesi, come la banda nota α2δ-1. I nostri risultati hanno dimostrato che anche l’efficacia del gabapentin (10 e 100 mg/Kg) nel test della formalina e nell’allodinia meccanica indotta dalla formalina, testato in topi C57BL/6 di 2 e 6 mesi, è risultata influenzata dall’invecchiamento. In particolare, nei topi giovani, solo la dose di 100 mg/Kg è risultata efficace in tutte le fasi del test della formalina, mentre, sia la dose più alta che la dose più bassa sono state efficaci nei topi di 6 mesi. A differenza dei topi di due mesi, i topi di 6 mesi non hanno mostrato cambiamenti significativi fra la soglia meccanica dei topi trattati con veicolo e quella dei topi trattati con il farmaco due ore dopo la somministrazione di formalina. Tuttavia, la somministrazione acuta di gabapentin è risultata più efficace sull’allodinia meccanica indotta dalla formalina nei topi di 6 che nei topi di 2 mesi, suggerendo che nei topi anziani, anche una dose più bassa di gabapentin risulta terapeutica ma l’effetto terapeutico ha più breve durata. Questo fenomeno potrebbe essere dovuto all’up-regulation della subunità α2δ-1 evidenziata nei topi anziani. In conclusione, i risultati ottenuti durante questo progetto di ricerca di dottorato caratterizzano il test della Formalina (Dubuisson & Dennis, 1977) come un valido modello di dolore cronico e dimostrano che il processo di invecchiamento influenza la soglia nocicettiva agli stimoli sia di natura meccanica che termica ed il comportamento nocifensivo in tale modello sperimentale di dolore cronico. I nostri risultati sono dotati di un notevole valore traslazionale per rispondere al bisogno, non ancora soddisfatto, di un migliore sfruttamento degli strumenti farmacologici già disponibili e di nuovi trattamenti terapeutici per la gestione del dolore cronico nei pazienti anziani.
Chenodeoxycholic acid (CDCA) through TGR5-dependent CREB-signaling activation enhances Cyclin D1 expression and promotes human endometrial cancer cell proliferation
(2011) Avena, Paola; Casaburi, Ivan; Sisci, Diego
Increasing epidemiologic data in humans as well as many in vitro investigative reports suggest that overweight and obesity are important risk factors for type-I EC which is the most common malignancy in women and accounts for 80% of all ECs. The strongest support for mechanisms to link obesity and cancer risk involves the metabolic and endocrine effects of obesity and the alterations that they induce in the production of peptide and steroid hormones. One way in which fat might exert its effect is stimulation of bile acids (BAs) synthesis and secretion. Bile acids (BAs) are amphipathic detergents that are synthesized in the liver and stored in the gallbladder. An important physiological role of BAs is to facilitate the uptake of lipids together with the fat-soluble vitamins A, D, E and K from the intestine. BAs facilitate these absorptive processes through their detergent properties, which allow the emulsification of lipids. Moreover, BAs have evolved over the past few years from being considered as simple lipid solubilizers to complex metabolic integrators. Beyond the orchestration of bile acids, lipid and glucose metabolism by the nuclear receptor farnesoid X receptor (FXR), BAs also act as signaling molecules through the non-genomic pathway activated by a BAdedicated G protein-coupled receptor (GPCR) TGR5 (also known as BG37 or MBAR). Despite the efficient enterohepatic recirculation of bile acids, a small amount of them can spill over into the systemic circulation particularly during high fat diet. Since in the obese women a strong correlation with endometrial cancer does exist, we investigated the biological effects of different concentrations of the primary bile acid CDCA in a human endometrial type-I cancer cell line, Ishikawa. Ishikawa cell proliferation was determined by [3H]-thymidine incorporation assay after 72 hours of treatment with different concentrations of CDCA. The effects of CDCA on the expression of the cell cycle regulatory proteins were evaluated by RT-PCR and Western blotting assays. Transient transfection method and mutagenesis studies were performed to functionally characterize the Cyclin D1 promoter while ChIP assay was to highlight the direct involvement of the ciselements in CDCA-dependent Cyclin D1 up-regulation. In addition, the effects of impaired expression and function of the proteins involved in CDCA activated signaling were assessed by using small interfering RNAs (siRNAs) technology. Our results indicate that low concentrations (< 30μM) of CDCA were able to stimulate Ishikawa cell growth as evidenced by [3H]Thymidine incorporation and cell cycle analysis by inducing a significant increase in Cyclin D1(CD1) protein and mRNA expression. In contrast, according to previous findings, high doses (> 50μ) of CDCA showed cytotoxic effects concomitantly with an increase of CDK inhibitor p21WAF1/CIP1 expression through a p53-indipendent pathway. Moreover, mutagenesis studies and ChIP analysis revealed that the CDCA-induced CD1 expression requires a cyclic AMP-responsive element (CRE) binding protein motif within the CD1 proximal promoter. Silencing of a cell surface bile acid sensor TGR5 and/or CREB gene expression by RNA interference reversed the CDCA-dependent induction of CD1 expression and proliferation in Ishikawa cells. In conclusion, extrahepatic spillover of BAs following high fat diet particularly in overweight and obese women, could be involved in the onset and/or maintenance of endometrial cancer by stimulation of TGR5 that activates ERK signaling that in turn induces the recruitment of the transcription factor CREB to the Cyclin D1 gene promoter enhancing cell proliferation
Cratterizzazione degli effetti neuroprotettivi della leptina in un modello sperimentale di ischemia cerebrale focale nel ratto
(2011) Petrelli, Francesco; Sisci, Diego; Amantea, Diana
La leptina, oltre ad avere effetti sull’ipotalamo per il controllo del peso corporeo, è coinvolta nella regolazione della funzionalità, dello sviluppo e della sopravvivenza neuronale. Studi recenti hanno evidenziato i suoi effetti neuroprotettivi nel danno ischemico cerebrale, ma fino ad oggi il ruolo del fattore di trasduzione ed attivatore trascrizionale (STAT)-3, il principale mediatore della via di trasduzione del segnale di ObR nel cervello, non è stato chiarito. I nostri dati dimostrano che la somministrazione sistemica acuta di leptina è neuroprotettiva in ratti sottoposti ad occlusione permanente dell’arteria cerebrale media (MCAo), come documentato dalla riduzione significativa del volume di infarto cerebrale e del deficit neurologico fino a 7 giorni dopo l’induzione di ischemia. Mediante analisi di immunofluorescenza e tecniche di frazionamento subcellulare abbiamo osservato che la neuroprotezione da leptina è associata con la modulazione dei livelli di fosforilazione di STAT-3 in differenti tipi cellulari nella corteccia cerebrale ischemica. Infatti, poche ore dopo l’insulto la leptina aumenta i livelli di p-STAT3 nel nucleo degli astrociti della penombra ischemica contribuendo così agli effetti benefici di queste cellule sull’evoluzione del danno. L’aumentata espressione di homer-1a che osserviamo negli astrociti fino a 7 giorni dopo l’induzione di ischemia, sottolinea ulteriormente il loro ruolo benefico. Mediante ricostruzione 3D di immagini di microscopia elettronica, combinata con analisi morfometrica, abbiamo osservato che gli astrociti reattivi mostrano un ridotto coverage bilaterale, mentre la percentuale di contatto con le sinapsi glutammatergiche rimane invariata. Inoltre, l’aumento di p-STAT3 indotto dalla leptina nei neuroni dopo 24h di MCAo è associato con un aumento dell’espressione dell’inibitore tissutale delle metalloproteasi della matrice (TIMP)-1 nella corteccia, suggerendo un suo coinvolgimento nella neuroprotezione indotta dall’adipochina
A cross- talk between estrogens and IGFIR pathways controls leydig and adrenocortical tumor cell proliferation
(2013) Zolea, Fabiana; Sisci, Diego; Pezzi, Vincenzo
DAX-1 at the connection between Androgen Receptor and Aromatase: a novel mechanism in the inhibition of estrogen-dependent cancer cell proliferation
(2012) Maris, Pamela; Sisci, Diego; Lanzino, Marilena
Dynamic effects of retinoic acid and its isomers on cancer and physiology
(2010-11-23) Perri, Mariarita; Bonofiglio, Daniela; Sisci, Diego
In the search for new cancer chemo-preventive compounds, hundreds of naturally occurring molecules have been evaluated. Among these, antioxidants appear to be very promising. In this contest, over the last decade retinoids, natural and synthetic substances structurally related to vitamin A, are often used as part of a combined therapy and have been object of intense investigation. However, clinical trials have shown that retinoids can also be deleterious and are associated with the activation of proto-oncogenes, leading to an increased incidence of neoplasias. In fact, retinoic acid (RA) partition is regulated by cognate intracellular lipid binding proteins (iLBPs): cellular retinoic acid binding protein II (CRABP-II) delivers RA to RARs, while fatty acid binding protein 5 (FABP5) shuttles the RA to PPARβ/δ. In cells with high CRABP-II/FABP5 ratio, RA functions through RAR acting as a pro-apoptotic agent, while signaling through PPARβ/δ promotes survival in those cells highly expressing FABP5. So that, in some tissues RA promotes cell survival and hyperplasia. The apparently conflicting data regarding the pro-oxidant/ anti-oxidant and proliferative/anti-proliferative potential of different retinoids molecules, stimulated us to investigate the effect of RA on cell proliferation and its mechanisms in two different tumor Leydig cell lines (MLTC-1 and R2C) using as normal phenotype counterpart the Leydig TM-3 cell line. Our previous data demonstrated how pharmacological doses of RA induce cell death via the apoptotic pathway in Leydic TM-3 cell line. Recently dose-response treatment of TM-3, MLTC-1 and R2C with RA at nutraceutic/physiological doses, promotes cell proliferation accompanied by stimulation of antioxidant enzymes activity (CAT, GST), decreases p21 levels and fosters cell cycle progression via activation of the IP3K/Akt pathway in the cancer cell line, while administration of pharmacological doses of RA still results in apoptosis. Interestingly treatment with 500 nM of RA resulted in cytosolic vacuolization, hallmark of the autophagic process. Autophagy is a major cellular pathway for the degradation of long-lived proteins and organelles in eukaryotic cells. A large number of intracellular/extracellular stimuli, including amino acid starvation, testosterone production and invasion of microorganisms are able to induce autophagic response. In addition, retinoic acid is also implicated in a post-translation modification called retinoylation that modify, in vitro, the activity of the mitochondrial carrier oxo-chetoglutarate (OCG). Moreover, retinoids are often used as part of a combined therapy, their action is prevalently mediated by two types of receptor RAR and RXR. This latter, is also called master coordinator due to its versatility to heterodimering with several nuclear receptor. Thus, we have elucidated the molecular mechanism by which combined treatment with rosiglitazone (BRL) and 9 cis retinoic acid (9cRA) at nanomolar doses triggers apoptotic events in breast cancer cells, suggesting potential therapeutic uses for these compounds, demonstrating an up-regulation of tumor suppressor gene p53 and its activity is due to the NFkB site, giving emphasis to the potential use of the combined therapy with low doses of both BRL and 9cRA as novel therapeutic tool particularly for breast cancer patients who develop resistance to anti-estrogen therapy. Recently, 9cRA was found as endogenous in pancreas highlighted its rule in both glucose stimulated insulin secretion (GSIS) mechanism and glucose homeostasis, establishing it as autocoid hormone with a unique physiological function among retinoids, and broaden insight into mechanisms of GSIS
Effects of adiponectin on the progression of breast cancer: role of Estrogen Receptor alpha
(2014-11-28) Ricchio, Emilia; Sisci, Diego; Mauro, Loredana
Adipose tissue is no longer considered an inert tissue for storing energy but is now recognized as an active endocrine organ secreting adipokines, cytokines and a diverse range of inflammatory markers. Adiponectin is one of the adipokines secreted by white adipose tissue and has been suggested to improve insulin sensitivity, regulate glucose and lipid metabolism and might play a role in the development of diabetes and atherosclerosis. In addition, it appears to play an important role also in the development and progression of several obesity-related malignancies, including breast cancer. In the present study, we demonstrated that adiponectin induces a dichotomic effect on breast cancer growth. Indeed, it stimulates growth in ERα-positive MCF- 7 cells while it inhibits proliferation of ERα-negative MDA-MB-231 cells. Notably, only in MCF-7 cells adiponectin exposure exerts a rapid activation of MAPK phosphorylation, which is markedly reduced when knockdown of the ERα gene occurred. In addition, adiponectin induces rapid IGF-IR phosphorylation in MCF-7 cells, and the use of ERα siRNA prevents this effect. Moreover, MAPK activation induced by adiponectin was reversed by IGF-IR siRNA. Coimmunoprecipitation studies show the existence of a multiprotein complex involving AdipoR1, APPL1, ERα, IGF-IR, and c-Src that is responsible for MAPK signaling activation in ERα-positive breast cancer cells. It is well known that in addition to the rapid effects through non-genomic mechanisms, ERα also mediates nuclear genomic actions. In this concern, we demonstrated that adiponectin is able to transactivate ERα in MCF-7 cells. We showed the classical features of ERα transactivation: nuclear localization, downregulation of mRNA and protein levels, and upregulation of estrogen dependent genes. Finally we demonstrate that in vivo adiponectin (1 and 5 μg/ml) induces a significant reduction (60 and 40%, respectively) in tumor volume in animals injected with human ERα-negative MDA-MB-231 cells, whereas an increased tumor growth (54 and 109%, respectively) is observed in the animals receiving human ERα-positive MCF-7 cells. Moreover, cyclin D1 (CD1) mRNA and protein levels are decreased in MDA-MB-231 cells, while they are upregulated in MCF-7 cells by adiponectin. Collectively, this study clarifies the molecular mechanism through which adiponectin modulates breast cancer cell growth, providing evidences on the celltype dependency of adiponectin action in relationship to ERα status.
Effetti dell'olio essenziale di Bergamotto (Citrus bergamia Risso et poiteau) su processo autofagico: identificazione dei meccanismi coinvolti e dei componenti responsabili
(2012) Cassiano, Valentina; Sisci, Diego; Corasaniti, Maria Tiziana
Nel presente studio, condotto in vitro, è stato valutato il coinvolgimento del processo autofagico negli effetti biologici dell’olio essenziale di bergamotto, BEO (Citrus Bergamia, Risso et Poiteau), un fitocomplesso dalle documentate proprietà farmacologiche, largamente impiegato nell’industria alimentare, farmaceutica, cosmetica e in aromaterapia (si veda: Bagetta et al., 2010). In particolare, è stata investigata l’espressione dei principali marker dell’autofagia in colture cellulari di neuroblastoma umano, SH-SY5Y, nelle quali erano stati precedentemente condotti sia gli studi di citoprotezione (Corasaniti et al., 2007) che di citotossicità (Berliocchi et al., 2011) con l’olio essenziale. Tale studio è stato esteso anche a colture di cellule ganglionari retiniche di ratto, RGC-5, e a colture di fibroblasti umani non tumorali, Hs 605.Sk. I risultati ottenuti dimostrano che il BEO, nelle linee cellulari studiate, induce un’autofagia funzionale, non abortiva, con un effetto che è concentrazione- e tempo-dipendente. Il meccanismo di tale induzione sembra essere indipendente sia da Beclin 1 che dalla via di mTOR. L’olio essenziale di bergamotto, inoltre, aumenta anche l’attività del sistema ubiquitina-proteosoma e quindi la capacità degradativa globale della cellula. L’autofagia indotta dal BEO non contribuisce alla citotossicità del fitocomplesso, ma esercita un ruolo citoprotettivo e gli effetti sulla pathway autofagica si osservano anche a concentrazioni di BEO che non producono tossicità. Grazie al presente studio sono stati identificati nel limonene e nel linalil acetato i due costituenti dell’olio essenziale principalmente responsabili della modulazione della via autofagica nelle cellule esposte al BEO. Questi composti agiscono entrambi da induttori dell’autofagia, con effetto additivo, riproducendo gli effetti del fitocomplesso. Alla luce dei dati raccolti, le prospettive future in questo ambito di ricerca sembrano essere promettenti. Sia il limonene che il linalil acetato sono due composti chimici ben caratterizzati e ritenuti sicuri per l’uomo, che potrebbero rivelarsi utili sia come tool farmacologici per lo studio del processo autofagico, sia come potenziali agenti terapeutici per il trattamento di tutte quelle condizioni patologiche (inclusi malattie neurodegenerative e cancro) in cui l’induzione dell’autofagia può risultare benefica.
Estrogen Receptor beta, through Sp1, recruits a corepressor complex to the Estrogen Receptor alpha gene promoter in breast cancer cells
(2012) Zito, Domenico; Sisci, Diego; Andò, Sebastiano
Human Estrogen receptors alpha (α) and beta (β) are essential components of a complex signal transduction pathway that regulates mammary growth and development. Several studies have reported that normal breast tissues display a relative higher expression of ERβ than ERα, which drastically changes during breast tumorogenesis. Thus, it is reasonable to suggest that a dysregulation of the two estrogen receptor subtypes may induce breast cancer development. However, the molecular mechanisms involved in the potential opposing roles played by the two estrogen receptors on tumor cell growth still needs to be elucidated. In the present study, we have demonstrated that ERβ overexpression in breast cancer cells decreases cell proliferation and down-regulates ERα mRNA and protein content, with a concomitant repression of estrogen-regulated genes. Transient transfection experiments, using a vector containing the human ERα promoter region, showed that elevated levels of ERβ down-regulated basal ERα promoter activity. Furthermore, site-directed mutagenesis and deletion analysis revealed that the proximal GC-rich motifs at −223 and -214 are critical for the ERβ-induced ERα down-regulation in breast cancer cells. This occurred through ERβ-Sp1 proteinprotein interactions within the ERα promoter region and the recruitment of a corepressor complex containing the nuclear receptor corepressor NCoR, accompanied by hypoacetylation of histone H4 and displacement of RNA polymerase II. Silencing of NCoR gene expression by RNA interference reversed the down-regulatory effects of ERβ on ER α gene expression and cell proliferation Collectively, these results suggest a novel mechanism by which overexpression of ERβ, through NCoR, is able to down regulate ERα expression, thus repressing ERα’s main role on breast cancer cell growth
Expression and function of phosphodiesterase Type 5 in human breast cancer cell lines and ttissues: implications for targeted therapy
(2015-12-18) Campana, Antonella; Sisci, Diego; Barone, Ines
FoxO3a reactivation restores the sensitivity to the antiestrogen treatment in tamoxifen resistant breast cancer
(2017-06-12) Donà, Ada Alice; Andò, Sebastiano; Sisci, Diego
Resistance to endocrine treatments is a major clinical challenge in the management of estrogen receptor alpha positive (ER+) breast cancers (BC). Although multiple mechanisms leading to endocrine resistance have been proposed, the poor outcome of this subgroup of BC patients demands additional studies. Here we show that the expression of FoxO3a transcription factor is strongly reduced in ER+ BC MCF-7 cells (wtMCF-7) that developed resistance to Tamoxifen (TamR). On the other hand, FoxO3a silencing (siF3a) was able to counteract Tam induced growth inhibition in wtMCF-7, demonstrating that FoxO3a is a mediator of cell response to Tam. To analyze the role of FoxO3a in the acquisition of a Tam resistant phenotype, TamR clones bearing an active FoxO3a (F3aAAA), whose expression can be induced by Doxycycline (Dox) were developed. FoxO3a re-activation was able to re-establish the sensitivity of TamR cells to the antiestrogen, inhibiting proliferation and cell cycle progression, as well as restoring Tam dependent apoptotic response. For a closer look at the molecular mechanisms involved, an unbiased proteomics analysis on F3aAAA-inducible TamR cells was conducted, unveiling novel interesting and potential mediators of the anti-proliferative and pro-apoptotic activity of FoxO3a, all worthy of future investigations. Kaplan-Meier (K-M) survival curves confirmed the relevance of FoxO3a also in a clinical setting, since high levels of the transcription factor strongly correlate to a positive response to tamoxifen therapy. Finally, to assess if FoxO3a reactivation is able to restore the sensitivity to Tam also in vivo, the widely used anti-epileptic drug (AED) Lamotrigine (LTG; Lamictal), which is able to induce FoxO3a expression in TamR cells leading to growth inhibition, was also tested on TamR deriving xenografts tumors, where it showed the same effects observed in vitro. Altogether, our data indicate that FoxO3a could not only be considered a good prognostic factor in ER+ BC, predicting a positive response to endocrine therapy, but also a key target to be exploited in combination therapy. In this context, LTG might represent a valid candidate to be used as an adjuvant to Tam therapy in patients at risk.
GPER mediates the up-regulation of acid synthase (fasn) intuced by 17B-estradiol in cancer cell and in cancer-associated fibroblasts (CAFs)
(2012-11-26) Santolla, Maria Francesca; Maggiolini, Marcello; Sisci, Diego
Activation of lipid metabolism is an early event in carcinogenesis and a central hallmark of many tumors. Fatty acid synthase (FASN) is a key lipogenic enzyme catalyzing the terminal steps in the de novo biogenesis of fatty acids. In cancer cells, FASN may act as a metabolic oncogene given that it confers growth and survival advantages to these cells, whereas its inhibition effectively and selectively kills tumor cells. Hormones like estrogens and growth factors contribute to the transcriptional regulation of FASN expression also through the activation of downstream signaling and a crosstalk among diverse transduction pathways. In this study, we demonstrate for the first time that 17β-estradiol (E2) and the selective GPER ligand G-1 regulate FASN expression and activity through the GPER-mediated signaling which involved the EGFR/ERK/c-fos/AP1 transduction pathway, as ascertained by using specific pharmacological inhibitors, performing gene-silencing experiments and ChiP assays in breast SkBr3, colorectal LoVo, hepatocarcinoma HepG2 cancer cells and breast cancerassociated fibroblasts (CAFs). In addition, the proliferative effects induced by E2 and G-1 in these cells involved FASN as the inhibitor of its activity, named cerulenin, abolished the growth response to both ligands. Our data suggest that GPER may be included among the transduction mediators involved by estrogens in regulating FASN expression and activity in cancer cells and CAFs that strongly contribute to cancer progression.
Hypocholesterolemic activity of brutieridin and melitidin enriched fraction from bergamot fruit (Citrus bergamia): in vivo and in vitro studies
(2012) Martello, Emanuela; Sisci, Diego; Dolce, Vincenza
Identificazione del recettore strogenico GPER (G-protein-couple estrogen receptor) nella ghiandola prostatica umana: valutazione del GPER nei tessuti prostateci benigni e neoplastici
(2015-12-18) Rago, Vittoria; Sisci, Diego; Carpino, Amalia
Gli estrogeni sono coinvolti nella crescita, differenziazione e patogenesi della prostata umana attraverso la mediazione dei classici recettori estrogenici (ER e ER). D'altro canto, il meccanismo non genomico degli estrogeni sembra esercitare un ruolo importante su segnalazioni di percorsi che dirigono o indirettamente modulano l'espressione genica. In questo scenario, il G protein-coupled receptor, GPER (precedentemente chiamato GPR30), è stato implicato nella mediazione rapida degli eventi trascrizionali in risposta agli estrogeni. Alcuni studi supportano l'ipotesi che GPER rappresenta un recettore estrogeno-sensibile e la sua iper-espressione sembra essere fondamentale i diverse patologie neoplasiche. L’espressione di GPER è stata recentemente evidenziata in alcuni tessuti riproduttivi umani, ma la sua espressione a livello prostatico è ancora sconosciuta. In questo studio, abbiamo valutato, l’espressione di GPER in 5 pazienti affetti da patologie prostatiche non neoplastiche, e in 50 pazienti affetti da adenocarcinoma, mediante analisi immunoistochimica e Western blot.. Le aree normali della prostata benigna hanno mostrato una forte immunoreattività del GPER nel citoplasma delle cellule epiteliali basali insieme ad una debole colorazione nel citoplasma delle cellule stromali. Nessuna immunocolorazione è stata invece osservata nelle cellule epiteliali luminali secretorie. L’analisi immunoistochimica ha evidenziato l’espressione cellulare di GPER in tutti i campioni di adenocarcinoma esaminati ma con una variabilità correlata alle diverse architetture delle cellule tumorali (Gleason patterns). Le regioni che presentavano lesioni pre-neoplastiche HGPIN (high-grade prostatic intraepithelial neoplasia) hanno evidenziato una intensa immunoreattività per il recettore, mentre nelle aree tumorali la positività al GPER è stata correlata ai “Gleason patterns” e valutata con il metodo di Allred. Una intensa immunoposititvità al GPER è stata evidenziata nelle aree tumorali Gleason pattern 2 e pattern Gleason 3 (leggermente ridotta in queste ultime), mentre debolmente colorate apparivano le aree con Gleason pattern 4. L’analisi Western blot degli estratti proteici benigni e tumorali ha confermato questo risultato. È stato inoltre osservato un aumento delle forme fosforilate dei livelli di Akt e di CREB nei campioni di pazienti affetti da adenocarcinoma scarsamente differenziato rispetto alle altre categorie. In conclusione, nel presente lavoro, per la prima volta, abbiamo identificato GPER nelle cellule basali epiteliali della prostata umana non neoplastica, con una diversa localizzazione rispetto ai classici recettori estrogenici. Abbiamo inoltre evidenziato l'espressione di GPER nelle cellule di adenocarcinoma prostatico ma con una modulazione della sua intensità dipendente dall’organizzazione delle cellule neoplastiche. La immunoreattività al GPER appare quindi inversamente correlata al grado di differenziazione tumoral
IGF system regulates GPER expression and function in cancer cells
(2014-11-28) De Marco, Paola; Maggiolini, Marcello; Sisci, Diego
Il trasportatore di carnitina OCTN2: espressione ed implicazioni fisiopatologiche
(2010) Scalise, Mariafrancesca; Indiveri, Cesare; Sisci, Diego
In the present work we studied the plasma membrane transporter of carnitine OCTN2. We firstly investigated the interaction of this transporter with a commonly used drug, the omeprazolo. The carnitine transporter was solubilized from rat renal apical plasma membrane (brush-border membrane) with C12E8 and reconstituted into liposomes removing the detergent from mixed micelles by hydrophobic chromatography on Amberlite XAD-4. The reconstituted carnitine transporter catalysed a first-order antiport reaction of carnitine with itself or other substrates stimulated by external, not internal, Na+, with a positive cooperativity. Na+ was co-transported with carnitine. The transporter is asymmetrical and it is unidirectionally inserted into the proteoliposomal membrane with an orientation corresponding to that of the native membrane. Omeprazole externally added to the proteoliposomes, inhibited the carnitine/carnitine antiport catalysed by the reconstituted transporter. The inhibition was reversed by the treatment of the proteoliposomes by DTE indicating that the inhibition was caused by the formation of omeprazole-transporter mixed disulphide. However, omeprazole caused inhibition of the transport also in the presence of DTE, indicating a second inhibition mechanism of non-covalent nature. The presence of the substrate during the incubation of the omeprazole with the proteoliposomes increased the formation of the mixed-disulphide. Omeprazole did not inhibited when present in the internal proteoliposomal compartment, indicating that the inhibition was specifically due to interaction with the external residues or sites of the protein. Omeprazole was not found to be transported by OCTN2: the structure of the activated form of omeprazole, indeed, possess a charged pyridine group and a methoxyl oxygen at a reciprocal distance of three carbon atoms which fulfil the requirement for interaction with the active site and inhibition but not for transport. The implication of the two mechanism of inhibition of the carnitine transporter in physiopathology may be relevant in the light of the omeprazole concentration reached in the blood after administration: the inhibition by omeprazole, indeed, may lead to a carnitine deficiency-like syndrome more or less evident, depending on the dose and on the individual capacity of metabolizing the drug. In the present work we studied, also, the human isoform of OCTN2: (i) we obtained the heterologous over-expression and the purification of hOCTN2 in a bacterial host, E. coli and (ii) we evaluated the expression profile of hOCTN2 in different cancer cell lines and in keratinocytes retrotransduced with HPV16 E6E7. The cDNA coding for hOCTN2 was cloned in two bacterial expression vector and, following two different strategies, we over-expressed the hOCTN2 protein as fusion protein with GST and as hOCTN2 without any tag but with codon bias. In both cases the protein was present in the insoluble fraction of induced lysate and was, then, solubilized with a ionic detergent, Sarkosyl, together with chaotropic agent, Urea. After solubilization the protein was purified on Nichel-chelating chromatography column, obtaining the protein solubilized in Triton X- 100. In the present work we described the expression profile of hOCTN2 in different cancer cell lines and in keratinocytes immortalized by HPV16E6E7: we observed a down-regulation at mRNA levels of hOCTN2 which was reversed by treating cells with 5-aza-cytidine a DNA demetilating agent. Cells over- expressing hOCTN2 were more sensitive to the chemotherapic agent cisplatin. This observation is a preliminary result suggesting a potential role of hOCTN2 in carcinogenesis or in cancer development.