Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra - Tesi di dottorato

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Questa collezione raccoglie le Tesi di Dottorato afferenti al Dipartimento Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra dell'Università della Calabria.

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    Angiotensin II and mechanisms of oxidative damage in HUVECs
    (2011-12-14) Carino, Annarita; Cerra, Maria Carmela; Martino, Guglielmo
    The endothelium is essential for the maintenance of vascular homeostasis. Central to this role is the production of endothelium – derived nitric oxide (EDNO), synthesized by endothelial isoform of nitric oxide synthase (eNOS). Endothelial dysfunction, manifested as impaired EDNO bioactivity, is an important early event in the development of various vascular disease, including hypertension, diabetes, genesis of tumors and atherosclerosis. Endothelial dysfunction is an early feature of atherosclerosis vascular disease, characterized by a decrease in nitric oxide (NO) bioavailability and a concomitant increase in vascular superoxide (O2 . -) formation. Loss of NO bioavailability precedes the development of overt atherosclerosis and is an independent predictor of adverse cardiovascular events. Indeed, decreased NO and enhanced production of reactive oxygen species (ROS) have been recognized as major determinants of age-associated endothelial dysfunction. The degree of impairment of EDNO bioactivity is a determinant of future vascular complications. Accordingly, growing interest exists in the pathologic mechanism involved. However it is clear that immunologic mechanisms operating in the context of common cardiovascular risk factors lead to impaired endothelial function, mainly as a consequence of decreased NO bioavailability and excessive oxidative stress. The work submitted in this thesis describes on one side studies aimed to investigate cellular mechanisms underlying endothelial dysfunction and vascular damages driven by oxidative stress in the context of aging, hypertension and atherosclerosis using in vitro models. In addition, we desired to evaluate the efficacy of reducing agents such as flavonoid to monitor whether they actually have an action to recover from the cellular oxidative damage by these natural compounds and how real is their action at the level of microcirculation in vitro models. On the other side, we present studies focused on the pathophysiology of microcirculation as far as functional aspects are concerned in the context to better understand the functioning of the Renin- Angiotensin-System in particular if the Angiotensin IV is involved in mechanisms of oxidative stress and in Calcium intracellular levels.
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    L’Angiotensina II modula il calcio intracellulare attivando AT1R, tramite la via di trasduzione dell’IP3 e i canali per il calcio di Tipo T (TCC).
    (2008) Martini, Aurela; Martino, Guglielmo; Canonaco, Marcello
    L’ Angiotensina II è il maggiore effettore del sistema renina-angiotensina. L’Angiotensina I, formata in seguito all’attività enzimatica della renina, interagisce con l’ACE plasmatico e con quello dell’endotelio polmonare convertendosi in Ang II.1 Successivamente l’Ang II è veicolata dal circolo ai suoi organi bersaglio regolando la pressione sanguigna, il bilancio idrico e il tono muscolare. Gli effetti indotti dal peptide sono mediate principalmente da due tipi di recettori di membrana, AT1 e AT2.2 I recettori AT1 stimolano un elevato numero di sistemi di trasduzione del segnale all’interno della cellula, quali fosfolipasi A (PLA), fosfolipasi D (PLD), fosfolipasi C (PLC), le MAP kinasi e la mobilizzazione del calcio intracellulare; infatti è ben nota la modulazione della concentrazione intracellulare di questo ione dall’idrolisi di fosfatidilinositolo-4,5-difosfato. Un’ ulteriore quantità di Ca2+ entra nella cellula anche dall’esterno grazie all’apertura dei canali del calcio. Recenti studi hanno dimostrato l’esistenza dei canali per il calcio di tipo T a livello delle cellule endoteliali, ma il loro vero ruolo non è ancora del tutto chiaro.3 Scopo dello studio: Esaminare il coinvolgimento dell’Ang II nell’incrementare la [Ca2+]i anche attraverso l’attivazione dei canali del calcio di tipo T nelle cellule HUVEC e determinare quale dei due recettori, AT1 o AT2, è coinvolto della attivazione di questi canali. La prima tappa di questo studio è stata la messa a punto del protocollo per la determinazione della vitalità cellulare, mediante l’ Arancio di Acridina, della concentrazione del Calcio, NO e ROS utilizzando rispettivamente le sonde: Fluo-3AM, DAF-2DA e HDCFH-DA. Metodo: Le HUVEC utilizzate al terzo passaggio, sono state mantenute e cresciute in coltura mediante mezzo specifico per cellule endoteliali EGM® Bullet Kit (Lonza) contenente 10% FBS. Le cellule sono state trattate con Ang II alle concentrazioni: 10-9 M o 10-7 M o 10-6 M in presenza o meno degli antagonisti dei recettori AT1 o AT2 per la messa a punto del protocollo. Nel secondo studio le cellule sono state trattate con Ang II alle suddette concentrazioni in presenza degli antagonisti e in presenza o meno dell’ inibitore della via IP3 o del TCC. Le cellule trattate con le sonde sono state osservate dopo 3, 6 e 9 ore. Le immagini sono state catturate col microscopio Olympus utilizzando ProImagePlus 4.0 ed analizzate col programma NIH ImageJ. Risultati: La valutazione dell’effetto dell’Ang II sulla vitalità e sulla modulazione della concentrazione del Calcio, NO e ROS a livello delle cellule endoteliali, ha evidenziato che la concentrazione ottimale per la valutazione degli effetti intracellulare di questo octapeptide nelle cellule endoteliali è 10-7 M; le cellule HUVUC rappresentano un buon modello per valutare l’azione dell’Ang II sull’ endotelio capillare. Il secondo studio ha dimostrato che l’ Ang II induce un alterazione del calcio intracellulare attraverso l’interazione col recettore AT1 stimolando la via IP3 per rapidi effetti fisiologi mentre attiva i canali del calcio di tipo T per tempi maggiori o uguali a 9 ore. Tali risultati suggeriscono che i T-Type Calcium channels regolano direttamente la permeabilità al calcio delle membrane plasmatiche di cellule HUVEC, mediante canali selettivi e non solo tramite la via IP3. Questo risultato mette in risalto il ruolo dei TCC nella regolazione metabolica e strutturale diretta delle cellule endoteliali, accanto a quella delle cellule muscolari lisce dei capillari.