Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra - Tesi di dottorato

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Questa collezione raccoglie le Tesi di Dottorato afferenti al Dipartimento Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra dell'Università della Calabria.

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Author: search.filters.author.Angelone, Tommaso

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    Cateslytin and Chromofungin, two CgA derived peptides: actors of the immune and cardiac systems
    (2017-05-03) Scavello, Francesco; Canonaco, Marcello; Angelone, Tommaso; Schneider, Francis; Metz-Boutigue, Marie-Hélène
    Chromogranin A (CgA) belongs to the granin family of uniquely acidic secretory that are ubiquitous in secretory cells of the nervous, endocrine, immune system. Numerous cleavage products of the granins have been identified, some of these peptides showed biological activities and are costored in secretory granules of different cells. Chromofungin (Chr: CgA47-66) and Cateslytin (Ctl: CgA344–358) are peptides that display antimicrobial activities and activate neutrophils, with important implications in inflammation and innate immunity. Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen and the leading cause of a wide range of severe clinical infections and one of the most important cause of hospital-acquired infections, in fact infections caused by this bacterium have classically an important impact in morbidity and mortality in the nosocomial and community scene. Furthermore, this pathogen is the primary cause of surgical site infections and the most frequently isolated pathogen in Gram-positive sepsis. In the specific field of cardiovascular disease S. aureus leading infective cause of destruction of endocardial tissue after implantation of prosthetic heart valve. This pathogen is also notorious for its ability to resist the available antibiotics and dissemination of various multidrug-resistant S. aureus clones that limit therapeutic options for a S. aureus infection. Aslam et al. in 2013 shown that Ctl is resistant to the degradation of S. aureus protease and is the most antibacterial CgA derived peptide against this bacterium. The aim of study was to evaluate the: 1) Effects of Chr on isolated and Langendorff perfused rat hearts in basal and pathological conditions; 2) In vitro antibacterial activity of a synthetic Cateslytin-derived peptide to cover artificial heart valves and prevent infection by S. aureus; 3) In vivo antibacterial activity of Ctl in rat infected with S. aureus. The first part of the study was performed by using the isolated and Langendorff perfused rat hearts, Elisa assay and real-time PCR. We found that, under basal conditions, increasing doses (11–165 nM) of Chr induced negative inotropic effects without changing coronary pressure. The AKT/eNOS/cGMP/PKG pathway mediated this action. We also found that Chr acted as a postconditioning (PostC) agent against ischemia/reperfusion (I/R) damages, reducing infarct size and LDH level. Cardioprotection involved PI3K, RISK pathway, MitoKATPand miRNA-21. Therefore, we suggest that Chr directly affects heart performance, protects against I/R myocardial injuries through the activation of prosurvival kinases. Results may propose Chr as a new physiological neuroendocrinemodulator able to prevent heart dysfunctions, also encouraging the clarification of its clinical potential. In the second part of the study, two new synthetic peptides containing Ctl (RSMRLSFRARGYGFR) were designed: D*T*Ctl (DOPA-K-DOPA-K-DOPATLRGGE- RSMRLSFRARGYGFR), T*Ctl (TLRGGE-RSMRLSFRARGYGFR) with D*: DOPA-K-DOPA-K-DOPA and T*: TLRGGE. This study is based on the observation of the adhesive properties of the DOPA-K-DOPA-K-DOPA sequence and on the ability of S. aureus endoprotease Glu-C to cleave the TLRGGE sequence. Firstly, using techniques of biochemistry, proteomics (sequencing, mass spectrometry) and microbiology we shown that the digestion by the Glu-C protease of T*Ctl and D*T*Ctl is able to release active Ctl. The prediction analisys of the secondary structure suggested the presence of an alpha helix domain in the case of D*T*Ctl with respect to T*Ctl. The D* group stabilized the secondary structure and facilitated the cleavage by Glu-C to the release of the active peptide Ctl. Subsequently, the effect of the oxidation by NaIO4 of D*T*Ctl on the release of Ctl and the antibacterial activity was analized. Proteomic analysis showed the formation of polymers inhibiting the action of Glu-C and the release of Ctl. We also shown that D*T*Ctl had a MIC value around 75 μM against different strains of S. aureus. This data shown that D*T*Ctl had a direct action against the bacteria without Glu-C cleavage. However, in oxidizing conditions the formation of aggregates of D*T*Ctl reduced the antibacterial action of this synthetic peptide. In the last part of this thesis, we evaluated the in vivo antibacterial activity of Ctl and whether and to which extent Ctl elicit cardioprotection in rat infected with S. aureus, as a model of infection with this bacterium. Identification of specific molecular targets of tissue and systemic inflammation and damage were analysed by Western blotting, ELISA and microbiological analysis in cardiac homogenates and plasma. A strong reduction of plasma bacterial growth, TNF-α, IL-1β and LDH plasma levels was observed in infected rat treated with Ctl. Western blotting analysis of cardiac extracts showed that Ctl treatment is accompanied by reduction of expression of pro-inflammatory markers, such as iNOS and COX-2. These preliminary data suggest that in vivo Ctl treatment is able to counteract the deleterious effects of S. aureus, and elicits myocardial protection.
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    <> catestatina migliora la risposta Frank-Starling in cuori di ratto normotesi e ipertesi agendo come attivatore fisiologico del pathway trasduzionale ossido nitrico-dipendente
    (16-12-2015) Cantafio, Patrizia; Canonaco, Marcello; Angelone, Tommaso
    The myocardial response to mechanical stretch (Frank-Starling law) is an important physiological cardiac determinant. Modulated by many endogenous substances, it is impaired in the presence of cardiovascular pathologies and during senescence. Catestatin (CST: hCgA352-372), a 21-amino-acid derivate of Chromogranin A (CgA), displays hypotensive/vasodilatory properties and counteracts excessive systemic and/or intra-cardiac excitatory stimuli (e.g., catecholamines and endothelin-1). CST, produced also by the myocardium, affects the heart by modulating inotropy, lusitropy and the coronary tone through a Nitric Oxide (NO)-dependent mechanism. This study evaluated the putative influence elicited by CST on the Frank-Starling response of normotensive Wistar Kyoto (WKY) and hypertensive (SHR) hearts by using isolated and Langendorff perfused cardiac preparations. Functional changes were evaluated on aged (18-month-old) WKY rats and SHR which mimic human chronic heart failure (HF). Comparison to WKY rats, SHR showed a reduced Frank-Starling response. In both rat strains, CST administration improved myocardial mechanical response to increased end-diastolic pressures. This effect was mediated by EE/IP3K/NOS/NO/cGMP/PKG, as revealed by specific inhibitors. CST-dependent positive Frank-Starling response is paralleled by an increment in protein S-Nitrosylation, AKT/eNOS/nNOS and PLN phosphorylations. Our data suggested CST as a NO dependent physiological modulator of the stretch-induced intrinsic regulation of the heart. This may be of particular importance in the aged hypertrophic heart, whose function is impaired because of a reduced systolic performance accompanied by delayed relaxation and increased diastolic stiffness.
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    Il ruolo della Cromogranina A e dei suoi peptidi derivati, Serpinina e Catestatina, nella fisiopatologia cardiaca
    (2012-11-24) Gentile, Stefano; Cerra, Maria Carmela; Angelone, Tommaso; Canonaco, Marcello
    Il ruolo cardiovascolare della CgA e dei suoi peptidi bioattivi è stato ampiamente documentato. I livelli plasmatici di CgA (range fisiologico da 0.5nM a 5nM), inizialmente utilizzati nella pratica clinica come biomarker di tumori neuroendocrini (O’Connor and Bernstein, 1984; Stridsberg and Husebye, 1997), rappresentano anche un importante marker per le disfunzioni del sistema cardiocircolatorio come ad esempio l’ipertensione essenziale, le cardiomiopatie ipertrofico/dilatative e l’insufficienza cardiaca (Ceconi et al., 2002). Recentemente Jansson et al. (2009), e Rosjo et al. (2010), hanno dimostrato che i livelli di CgA nella sindrome coronarica acuta forniscono informazioni prognostiche indipendentemente dagli altri markers di rischio convenzionali. L’importanza della CgA nella biologia cardiaca è inoltre supportata dall’osservazione che la delezione del gene per la CgA nei topi provoca lo sviluppo di ipertensione, che può essere riportata a livelli fisiologici trattando gli animali con CST o reintroducendo il gene per la CgA in topi con background Chga-/- (Mahapatra et al., 2005). I livelli plasmatici di CgA aumentano in condizioni di eccessiva stimolazione del sistema simpatico, particolarmente evidente nell’insufficienza cardiaca. Ceconi et al. (2002) e Pieroni et al. (2007), hanno dimostrato che in pazienti affetti da insufficienza cardiaca le concentrazioni plasmatiche di CgA sono aumentate (10-20 nM; 500-1000ng/ml), e strettamente correlate alla severità della patologia. Al momento non sono però disponibili informazioni sugli effetti diretti della CgA intera sul cuore, e sui fattori che regolano la sua produzione e processamento a livello miocardico.Il presente lavoro ha quindi lo scopo di chiarire se, e in che misura, la CgA intera induce effetti diretti sulla performance cardiaca, e la possibilità di un processamento proteolitico intracardiaco stimolo-dipendente della proteina. Utilizzando ratti normotesi (WKY) e ipertesi (SHR), abbiamo valutato i) gli effetti miocardici e coronarici della CgA intera nel cuore di ratto isolato e perfuso secondo metodica Langendorff; ii) il pathway trasduzionale (Akt/NOS/NO/cGMP/PKG) coinvolto nel suo meccanismo d’azione; iii) il processamento intracardiaco della CgA in seguito a stimolazione -adrenergica con ISO. Dal processamento della CgA deriva una serie di peptidi bioattivi; fra questi i peptidi N-terminali VS-1/2, (VS-1 CgA1-76; VS-2 CgA1-113), e il peptide C-terminale CST (CgA352-372), hanno effetti cardioattivi. La CST promuove l’angiogenesi (Theurl et al., 2010), abbassa la pressione sanguigna (Mahapatra et al., 2005; Fung et al., 2010; Gaede and Pilowsky, 2012), riduce la contrattilità cardiaca (Angelone et al., 2008; Mazza et al., 2008; Imbrogno et al., 2010), e incrementa la sensibilità dei barocettori (Gayen et al., 2009a; Gaede and Pilowsky, 2010). Recentemente è stato scoperto un nuovo frammento derivato dalla CgA. A livello della regione C-terminale, altamente conservata, il clivaggio proteico ad opera delle pro-ormone convertasi (PC1/2/3), genera un frammento di 2.9 kDa, la “serpinina” (Ala26Leu), il quale può subire una modificazione all’estremità N-terminale per formare un residuo di piro-glutammato (pGlu23Leu o pGlu-serpinina) (Koshimizu et al., 2011a,b). La presenza di entrambe le forme di serpinina è stata rilevata in colture di cellule di ghiandola pituitaria (AtT20). Questi peptidi sono in grado di inibire la morte cellulare indotta da stress ossidativo (Koshimizu et al., 2011a), e di promuovere la biogenesi dei granuli secretori nelle cellule endocrine regolando l’espressione di un inibitore delle proteasi, la proteasi nexina-1 (PN-1), che previene la degradazione delle proteine dei granuli nell’apparato di Golgi. È stato osservato che i peptidi della serpinina agiscono attraverso il pathway AC/cAMP/PKA (Koshimizu et al., 2011b), suggerendo che il meccanismo eccitatorio indotto dalla serpinina potrebbe controbilanciare gli effetti antiadrenergici e cardioinibitori indotti dalla CST e VS-1. Ad oggi non esistono evidenze sperimentali sul possibile ruolo cardioattivo della serpinina; pertanto nel presente lavoro di tesi è stata valutata la presenza di questo peptide e delle sue forme alternative nel cuore di ratto; è stato inoltre osservato in che modo influenzano la performance miocardica e la vasoattività coronarica. La serpinina e la pGlu-serpinina inducono un effetto positivo dose-dipendente sulla contrazione (inotropismo) del cuore di ratto isolato e perfuso secondo metodica Langendorff e sui muscoli papillari isolati, nonché sul rilassamento (lusitropismo) miocardico. Questi effetti miocardici sono stati accompagnati da una lieve, ma non significativa, vasodilatazione coronarica. Un terzo peptide, la serpinina Ala29Gly, non ha influenzato la performance cardiaca a nessuna delle concentrazioni testate. Sia la serpinina che la pGlu-serpinina sembrano agire attraverso il pathway 1-AR/AC/cAMP/PKA. Questi dati evidenziano le proprietà cardio-circolatorie della serpinina e della pGlu-serpinina, fornendo ulteriori informazioni su come i peptidi CgA derivati possano, controbilanciandosi, regolare finemente l’attività cardiaca in risposta a stimoli -adrenergici.Il quadro clinico dei pazienti affetti da cardiopatie è complicato da un’altra patologia che si accompagna spesso alle cardiopatie, la sindrome metabolica. E’ stato constatato, infatti, che circa il 30% di pazienti con cardiopatia ischemica acuta sono affetti da sindrome metabolica (ad esempio diabete, obesità). Il peptide CgA derivato prancreastatina (CgA250-301, PST) (Tatemoto et al., 1986; O’Connor et al., 2005; Gayen et al., 2009b), svolge diverse funzioni a livello metabolico, in particolare sul metabolismo del glucosio (Tatemoto et al., 1986). Tuttavia non sembra avere effetti a livello cardiovascolare. Studi recenti hanno evidenziato il ruolo della PST e della CST nel regolare la secrezione di insulina mantenendo l’omeostasi fra l’effetto anti-insulina della PST, e gli effetti insulino-sensitizzante della CST. (Gayen et al., 2009b). È stata valutata la possibile azione della CST sul metabolismo lipidico che, come è ben noto, risulta alterato nei soggetti obesi. Le cellule adipose sono regolate dalle catecolamine attraverso quattro tipi di AR: 1, 2, 3 e 2 (Arner, 1999; Arner, 2005). L’attivazione dei recettori -AR, coinvolgento le proteine G stimolatorie, aumenta la produzione di cAMP; questo a sua volta attiva la PKA, la quale fosforila la lipasi ormone sensibile (HSL) causando l’idrolisi dei lipidi. Al contrario, l’attivazione dei recettori 2-AR, accoppiati a proteine G inibitorie, inducono effetti opposti sulla lipolisi (Lafontan et al., 1997; Stich et al., 1999, 2003; Lafontan and Langin, 2009). Pertanto l’azione netta delle catecolamine sulla lipolisi dipende dall’equilibrio fra recettori - e -AR (Arner, 2005). Normalmente l’azione lipolitica indotta dai recettori -AR prevale sull’azione -AR. Una continua stimolazione del sistema nervoso simpatico o un aumento delle catecolamine plasmatiche, è spesso associato alla desensitizzazione dei -AR (Mori et al., 2007). Studi in vivo hanno dimostrato che l’azione lipolitica delle catecolamine è ridotta nei soggetti obesi (Bougneres et al., 1997; Jensen, 1997). Il trattamento ripetuto con epinefrina induce soppressione della lipolisi, basale e indotta da epinefrina, sia in soggetti normopeso che obesi (Townsend et al., 1994). Anche negli studi in vitro la risposta lipolitica indotta dall’epinefrina è diminuita dal pretrattamento con la stessa molecola (Stallknecht et al., 1997). Sulla base di questi dati, è stato ipotizzato che l’aumentata massa adiposa dei topi iperadrenergici Chga-KO (Gayen et al., 2009a) possa rispecchiare la desensitizzazione dovuta all’aumento delle catecolamine circolanti (Mahapatra et al., 2005). I topi Chga-KO mostrano, nonostante gli elevati livelli circolanti di catecolamine e leptina, una notevole adiposità. Le catecolamine inibiscono la secrezione della leptina (Fritsche et al., 1998; Scriba et al., 2000; Couillard et al., 2002); la desensitizzazione del -AR potrebbe prevenire tale effetto, causando un aumento dei livelli di leptina e della massa adiposa, così come mostrato nei topi Chga-KO e in altri modelli sperimentali di obesità. Come osservato nei topi DIO (diet induced obesity), l’aumento di leptina circolante induce la desensitizzazione dei recettori per la leptina, possibile causa del fenotipo obeso dei topi Chga-KO. Sulla base di queste osservazioni, è stato ipotizzato che la CST possa ridurre l’obesità ripristinando la sensibilità dei recettori adrenergici e dei recettori per la leptina attraverso la normalizzazione dei livelli plasmatici di catecolamine e leptina. È stato infatti osservato che il trattamento cronico con CST induce una significativa riduzione della massa adiposa nei topi Chga-KO. Il trattamento con CST ha inoltre determinato una riduzione del peso corporeo e della massa adiposa anche nei topi DIO, senza alterare l’assunzione di cibo. Sia nei topi DIO che nei topi ob/ob, in cui l’obesità è dovuta all’incapacità di produrre leptina, la CST è in grado di incrementare gli effetti della leptina sul metabolismo e sul signaling del tessuto adiposo. Le nostre osservazioni suggeriscono che la riduzione della massa grassa dopo trattamento cronico con CST è dovuta ad un aumento della lipolisi e della mobilizzazione dei lipidi; inoltre sembra che la CST agisca attraverso i recettori 2-AR e i recettori per la leptina. In linea con tali osservazioni, la CST promuove l’ossidazione degli acidi grassi e il signaling della leptina.
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    Ruolo di GPER sulla funzione cardiovascolare in condizioni di ipertensione: caratterizzazione fisiologica del recettore in Ratti Spontaneamente ipertesi (SHR)
    (2013-11-25) De Francesco, Ernestina Marianna; Maggiolini, Marcello; Angelone, Tommaso
    Estrogens promote beneficial effects in the cardiovascular system mainly through the estrogen receptor (ER)α and ERβ, which act as ligand-gated transcription factors. Recently, the G protein-coupled estrogen receptor (GPER) has been implicated in the estrogenic signaling in diverse tissues, including the cardiovascular system. In this study, we demonstrate that left ventricles of male Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) express higher levels of GPER compared to normotensive Wistar Kyoto (WKY) rats. In addition, we show that the selective GPER agonist G-1 induces negative inotropic and lusitropic effects to a higher extent in isolated and Langendorff perfused hearts of male SHR compared to WKY rats. These cardiotropic effects elicited by G-1 involved the GPER/eNOS transduction signaling, as determined by using the GPER antagonist G-15 and the eNOS inhibitor L-NIO. Similarly, the G-1 induced activation of ERK1/2, AKT, GSK3β, c-Jun and eNOS was abrogated by G-15, while L-NIO prevented only the eNOS phosphorylation. In hypoxic Langendorff perfused WKY rat heart preparations, we also found an increased expression of GPER along with that of the hypoxic mediator HIF-1α and the fibrotic marker CTGF. Interestingly, G-15 and L-NIO prevented the ability of G-1 to down-regulate the expression of both HIF- 1α and CTGF, which were found expressed to a higher extent in SHR compared to WKY rat hearts. Collectively, the present study provides novel data into the potential role played by GPER in hypertensive disease on the basis of its involvement in myocardial inotropism and lusitropism as well as the expression of the apoptotic HIF-1α and fibrotic CTGF factors. Hence, GPER may be considered as a useful target in the treatment of some cardiac dysfunctions associated with stressful conditions like the essential hypertension.