Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra - Tesi di dottorato

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Questa collezione raccoglie le Tesi di Dottorato afferenti al Dipartimento Dipartimento di Biologia, Ecologia e Scienze della Terra dell'Università della Calabria.

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Author: search.filters.author.Canonaco, MarcelloSubject: search.filters.subject.Biologia animale

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    Ruolo del sistema Glutammatergico nella plasticità neuronale amigdalare del Mesocricetus auratus
    (2008) Granata, Teresa; Canonaco, Marcello
    La plasticità sinaptica è un meccanismo neuronale alla base di funzioni complesse del Sistema Nervoso Centrale, come l’apprendimento e la memoria. Tali funzioni sono associate a eventi di potenziamento e depressione sinaptici necessari ad evitare che tutte le sinapsi vadano incontro a saturazione e prevenire cicli di feedback positivo tra l’attività della rete di neuroni e la forza sinaptica. I neuroni di per sé regolano le trasmissioni eccitatorie tramite la variazione del numero e della composizione sinaptica di alcuni sistemi recettoriali come quello glutammatergico. Un ruolo centrale nel controllo della plasticità neuronale è svolto sia dai recettori dell’NMDA che dell’AMPA, costituiti entrambi da diverse subunità recettoriali la cui variazione nella composizione e reciproca organizzazione determina la formazione di recettori con caratteristiche cinetiche e farmacologiche differenti, regolando i processi di plasticità sinaptica sia durante le fasi critiche dello sviluppo encefalico che di particolari stadi fisiologici quali l’ibernazione. In virtù di ciò, il Mesocricetus auratus, un roditore ibernante facoltativo, ha rappresentato un valido modello sperimentale per gli studi neurobiologici condotti in questo lavoro. In un simile contesto, un elemento chiave della regolazione plastica è costituito dal controllo eccitazione-inibizione attraverso fenomeni di cross-talking tra i recettori glutammatergici e quelli GABAergici. In questo lavoro si è evidenziato come l’attivazione di due delle principali subunità recettoriali GABAergiche, quali α1 e α5, abbia determinato un controllo negativo sulle azioni esplicate dagli agonisti glutammatergici, sia nel contesto delle attività di feeding e drinking behavior che dal punto di vista molecolare. Infatti, la subunità α1 si oppone maggiormente alle variazioni nella capacità e/o nella volontà di assumere acqua e cibo, in seguito all’azione dell’NMDA esplicata nell’area di transizione tra l’ipotalamo e l’amigdala, sia in eutermia che in ibernazione; diversamente α5 modula il comportamento alimentare AMPA-dipendente riconducibile all’attività dell’amigdala. E’ stato, inoltre, evidenziato, mediante l’ibridazione in situ, che le maggiori variazioni trascrizionali delle subunità recettoriali glutammatergiche avvengono in seguito alla modulazione per lo più inibitoria esercitata dal sistema GABAergico principalmente attraverso la subunità α5. Questo controllo trascrizionale sarebbe il risultato di meccanismi molecolari atti a modulare l’azione di fenomeni altamente eccitatori attraverso sofisticati processi di feedback negativo: il GABA, ormai inibitorio nell’encefalo adulto, tende a silenziare l’attivazione dei recettori eccitatori, modulando la trascrizione delle loro subunità recettoriali. Un simile meccanismo assume un ruolo funzionale importante nel controllo del ciclo di ibernazione, soprattutto del risveglio, quando potrebbero innescarsi fenomeni eccitotossici simil-ischemici che indurrebbero morte cellulare.
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    L’Angiotensina II modula il calcio intracellulare attivando AT1R, tramite la via di trasduzione dell’IP3 e i canali per il calcio di Tipo T (TCC).
    (2008) Martini, Aurela; Martino, Guglielmo; Canonaco, Marcello
    L’ Angiotensina II è il maggiore effettore del sistema renina-angiotensina. L’Angiotensina I, formata in seguito all’attività enzimatica della renina, interagisce con l’ACE plasmatico e con quello dell’endotelio polmonare convertendosi in Ang II.1 Successivamente l’Ang II è veicolata dal circolo ai suoi organi bersaglio regolando la pressione sanguigna, il bilancio idrico e il tono muscolare. Gli effetti indotti dal peptide sono mediate principalmente da due tipi di recettori di membrana, AT1 e AT2.2 I recettori AT1 stimolano un elevato numero di sistemi di trasduzione del segnale all’interno della cellula, quali fosfolipasi A (PLA), fosfolipasi D (PLD), fosfolipasi C (PLC), le MAP kinasi e la mobilizzazione del calcio intracellulare; infatti è ben nota la modulazione della concentrazione intracellulare di questo ione dall’idrolisi di fosfatidilinositolo-4,5-difosfato. Un’ ulteriore quantità di Ca2+ entra nella cellula anche dall’esterno grazie all’apertura dei canali del calcio. Recenti studi hanno dimostrato l’esistenza dei canali per il calcio di tipo T a livello delle cellule endoteliali, ma il loro vero ruolo non è ancora del tutto chiaro.3 Scopo dello studio: Esaminare il coinvolgimento dell’Ang II nell’incrementare la [Ca2+]i anche attraverso l’attivazione dei canali del calcio di tipo T nelle cellule HUVEC e determinare quale dei due recettori, AT1 o AT2, è coinvolto della attivazione di questi canali. La prima tappa di questo studio è stata la messa a punto del protocollo per la determinazione della vitalità cellulare, mediante l’ Arancio di Acridina, della concentrazione del Calcio, NO e ROS utilizzando rispettivamente le sonde: Fluo-3AM, DAF-2DA e HDCFH-DA. Metodo: Le HUVEC utilizzate al terzo passaggio, sono state mantenute e cresciute in coltura mediante mezzo specifico per cellule endoteliali EGM® Bullet Kit (Lonza) contenente 10% FBS. Le cellule sono state trattate con Ang II alle concentrazioni: 10-9 M o 10-7 M o 10-6 M in presenza o meno degli antagonisti dei recettori AT1 o AT2 per la messa a punto del protocollo. Nel secondo studio le cellule sono state trattate con Ang II alle suddette concentrazioni in presenza degli antagonisti e in presenza o meno dell’ inibitore della via IP3 o del TCC. Le cellule trattate con le sonde sono state osservate dopo 3, 6 e 9 ore. Le immagini sono state catturate col microscopio Olympus utilizzando ProImagePlus 4.0 ed analizzate col programma NIH ImageJ. Risultati: La valutazione dell’effetto dell’Ang II sulla vitalità e sulla modulazione della concentrazione del Calcio, NO e ROS a livello delle cellule endoteliali, ha evidenziato che la concentrazione ottimale per la valutazione degli effetti intracellulare di questo octapeptide nelle cellule endoteliali è 10-7 M; le cellule HUVUC rappresentano un buon modello per valutare l’azione dell’Ang II sull’ endotelio capillare. Il secondo studio ha dimostrato che l’ Ang II induce un alterazione del calcio intracellulare attraverso l’interazione col recettore AT1 stimolando la via IP3 per rapidi effetti fisiologi mentre attiva i canali del calcio di tipo T per tempi maggiori o uguali a 9 ore. Tali risultati suggeriscono che i T-Type Calcium channels regolano direttamente la permeabilità al calcio delle membrane plasmatiche di cellule HUVEC, mediante canali selettivi e non solo tramite la via IP3. Questo risultato mette in risalto il ruolo dei TCC nella regolazione metabolica e strutturale diretta delle cellule endoteliali, accanto a quella delle cellule muscolari lisce dei capillari.
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    Azione cardiaca della catestatina in Rana esculenta
    (2014-03-26) Barbieri, Sandra Francesca; Canonaco, Marcello; Gattuso, Alfonsina; Mazza, Rosa
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    Molecole e correnti ioniche coinvolte nella maturazione ovocitaria in Ciona intestinalis (ascidie)
    (2014-03-25) Silvestre, Francesco; Canonaco, Marcello; De Santis, Rosaria; Tosti, Elisabetta
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    Meccanismi di Cross-talking tra i sistemi Orexinergico e GABAergico nei teleostei
    (2014-03-25) Crudo, Michele; Canonaco, Marcello; Facciolo, Maria
    The neuropeptides hypocretins/orexins (ORX) are known to control state-dependent activities such as sleep-wakefulness, energy homeostasis and reward/addiction processes. To date, interests regarding ORXergic neuronal functions have mostly dealt with mammals, while only recently attention is beginning to be directed towards aquatic vertebrates. On this basis, the intention of the present study was to evaluate ORX-A effects on behavioral and neuronal activities in marine (the ornate wrasse, Thalassoma pavo) and freshwater (the goldfish, Carassius auratus) teleost fishes. To achieve such aims behavioral, molecular and neurodegenerative analysis were performed following intraperitoneal injections of not only the most effective doses of ORX-A, but also of GABAAR β subunit agonist muscimol (MUS) and antagonist bicuculline (BIC) as well as a classical benzodiazepine, diazepam (DZP), and a non benzodiazepine, zolpidem (ZOL), that are instead agonists of the GABAAR α subunits. Behavioral studies on explorative behaviors (swimming towards food sources; STF), free swimming (FS) and on resting states (R) displayed that ORX-A was responsible for very great (p<0.001) enhancements of STF in both teleosts while similarly very great and great (p<0.01) reduction of R was detected in wrasse and goldfish, respectively. Interestingly, ORX-A effects showed to be strongly influenced by environmental photoperiodic conditions as pointed out by behavioral and ORXR expression relationships in wrasses during constant light/dark conditions. In this case, ORX-A/photoperiodic-dependent motor behaviors might be related to a structural-functional dichotomy of some motor-controlling brain regions. Indeed during the day, ORX-A might be very likely promoting the awakening state via low-affinity ORXR sites at hypothalamic (HTH) and mesencephalic (MES) levels so inducing the promotion of STF and FS. On the other hand, during the night ORX-A might result in a promotion of R via activation of mostly telencephalic (TEL) high-affinity sites. As far as GABAAR influence is concerned, MUS was capable of inducing a moderate (p<0.05) increase in STF and this tends to not only underlie a highly conserved GABA stimulus on feeding but also that such an activity relies on the involvement of ORXR in most brain regions of both fish models. Moreover, it was also possible to observe that such a GABAAR agonist elicits a neuroprotection via ORXR as suggested by both the reduction of BIC-dependent mRNA down-regulations and the very low argyrophilic reactions in brain regions of MUS+BIC-treated fish. When the increase of STF was next checked to see whether it was linked to an enhancement of food consumption, I observed that ORX-A and GABAAR  drugs (MUS and BIC) did not modify this activity. On the other hand, GABAAR  subunits appeared to not only influence STF maneuvers but also food consumption as demonstrated by ZOL and DZP evoking very great increases in STF coupled with great and very great amounts of food consumption, respectively. Interestingly, also in 8 this case ZOL- and DZP-dependent hyperphagia seemed to be correlated to ORXR expression variations in mostly HTH and MES, brain areas that are involved in energy homeostasis and motor activities. At this point it was interesting to investigate if ORX- and GABAAR-induced STF effects were mediated through rewarding pathways like that reported for mammals. With such an aim, T-maze and Conditioned Place Preference (CPP) paradigms were performed. For this part, ORX-A accounted for a moderate improvement of T-maze performances that became great when associated to color visual stimuli, suggesting that ORX-A might be operating on memory processes also in fish. Moreover from CPP analysis in which ORX-A acted as a main agent responsible for great increase of color-dependent change in CPP, it seems that this neuropeptide and not GABAAR drugs, might be potentiating reward pathways in goldfish. Also in this case, behavioral performances are consistent with ORXR up-regulations in some TEL regions and in the nucleus of the posterior tuberculum, homologous of the amygdala plus hippocampus and ventral tegmental area that in mammals control learning and reward processes. It is worthy to note that DZP only accounted for a moderate increase in CPP change while BIC completely blocked ORX-A-induced change in CPP and this tends to point to a dual neurosignaling mechanism between ORX circuit and GABAAR / subunits on motivational-reward behaviors. Overall these results highlight, for the first time, not only an ORX neuronal driving force operating on feeding behaviors in goldfish, but above all its participation in the control of goal-oriented behaviors like in mammals.
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    Ruolo del cross-talking GABA-glutammato nello sviluppo morfo-funzionale dei neuroni ippocampali di Mesocricetus auratus
    (2014-03-24) Di Vito, Anna; Cerra, Maria Carmela; Canonaco, Marcello
    The hippocampus (HIP) is recognized as a major telencephalic area processing learning and episodic memory events through the accumulation of neuronal signals deriving from the different subregions. In particular, hippocampal neurons have received particular attention due to some of their functional properties being regulated by GABAergic and Glutamat- (Glu)-ergic neuronal signals during both postnatal and adult stages. For the present study, growth of hamster hippocampal neurons on biohybrid membrane substrates allowed us to show for the first time that the two major GABAA α receptor subunits (α2,5) promote early neuronal shaping plus expression differences of the main neuronal cytoskeletal factors (GAP-43, MAP2, Syn, the neurotrophin BDNF) along with Gluergic subtypes. In a first case, the selective GABAAR agonist diazepam (DZP; α2,5) caused very great (p<0.001) increases of dendritic sprouting and branching processes mainly at DIV3, while its effects continued to account even for great (p<0.01) axonal length during the entire culture period. In addition, DZP also accounted for great (p<0.01) up-regulation of neuritic NR1, GluR2 and MAP2 while it moderately (p<0.05) increased synaptophysin (Syn) at DIV7. Such effects were abolished by its highly selective antagonist flumazenil. The application of the inverse α5 agonist (RY-080) tended to strongly suggest its specific role on the dendritic component via the inhibition of BDNF, as shown by a reduction of dendritic length at DIV7 concomitantly to very low levels of the neurotrophin. Conversely, the effects of the preferentially specific agonist for hippocampal α2 subunit (flunitrazepam) were, instead, directed at the formation of growth cones at DIV3 in the presence of greatly (p<0.01) diminished GAP-43 levels as displayed by strongly reduced axonal sprouting. It is interesting to note that contextually to these morphological variations, the transcription of some Gluergic receptor subtypes resulted to be altered. Indeed, the α2 agonist was responsible for a distinctly rising expression pattern of axonal NR1 mRNA levels from DIV3 (p<0.01) until DIV7 (p<0.001), along with a very great up-regulation of Syn at DIV7. In the case of RY-080, it evoked a very great (p<0.001) downregulation of dendritic GluR2 at only DIV7. Together, our results demonstrate that GABAA α2,5 receptor-containing subunits are considered key modulating neuronal elements of HIP morphological features by regulating the precise synchronization of cytoskeletal factors. Moreover, the notable NR1 and GluR2 transcription differences promoted by these GABAA α subunits tend to favorably corroborate the early role of α2 + α5 on HIP neuronal networks in hibernating rodents through the recruitment and activation of silent neurons. We are still at the beginning but further studies are required to establish the nature of molecular signals controlling responses of the different hippocampal subregions, which may have therapeutic bearings for neurological disorders.
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    Carabid beetles as natural antagonists of the olive fly Bactrocera oleae Rossi 1790
    (2014-03-20) Odoguardi, Rosalba; Canonaco, Marcello; Zetto, Tullia; Bonacci, Teresa