Dipartimento di Ingegneria dell'Ambiente - Tesi di Dottorato
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Questa collezione raccoglie le Tesi di Dottorato afferenti al Dipartimento di Ingegneria per l'Ambiente e il Territorio e Ingegneria Chimica dell'Università della Calabria.
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Item Dynamic operation and control of cell culture environments in bioreactors for bioartificial liver application(2017-07-11) Naghib, Seyed Danial; Pantano, Pietro; Di Renzo, Alberto; Curcio, Efrem; Di Maio, Francesco Paolo; De Bartolo, LoredanaOn the global scale, liver diseases are severe public health problems, with the incidences of end-stage liver disease (ESLD) rising annually. Isolated hepatocytes represent a good model of liver metabolism because they are able to perform the full range of functions. In recent years, biochemical and biotechnological engineering have been applied to the culture of human and animal hepatocyte cells, which requires the design, operation, and control of complex appropriate bioreactors. In this work, the predictable, stable and durable operation of two types of bioartificial reactors for cell cultures is investigated. The thesis is divided into the following two parts. Part I: Fluidized bed bioreactor Fluidized-bed-based biomedical devices acting as bioartificial liver, in which cells are trapped and encapsulated into appropriated fluidized beads, have proved effective solutions to many respects. However, the bioreactor performance is significantly affected by the hydrodynamics and mass transfer, not well characterized yet for most aspects. In the present work, the intrinsic and fluidization properties of alginate beads as encapsulation medium for hepatic cells are carefully analyzed experimentally using two rigs at different scales. Appropriate alginate beads were prepared and characterized in terms of size distribution and density. Expansion properties were evaluated for free alginate beads (i.e. without hepatic cells) using saline (Ringer) solutions as fluidization medium. Bed expansion tests over a wide range of voidage values have been conducted in a 1-cm diameter column, used for perfusion during in vitro experiments, as well as in a 10-cm diameter column close to human size bioreactor, in the latter case at two temperatures: ambient (20°C) and human body (37°C) conditions. Full fluid-dynamic characterization of the alginate beads is conducted, including expansion data, terminal velocity measurements, and velocity-voidage plots and their elaboration in terms of Richardson-Zaki parameters. Part II: Hollow fiber membrane bioreactor Due to their structure affine to the physiological environment in vivo, hollow fibre membrane bioreactors in crossed configuration can provide favourable conditions for the cell behaviour and metabolism. Specific devices have been proposed in recent years with very promising potential for applications. To be able to develop bioartificial systems that operate effectively and for the long term, in addition to handling the biological complexities, fluid dynamics and transport phenomena require an advance model, careful control, and appropriate automation strategies. Tight control of the culturing environment and strategies for dealing with some inherently unsteady changes of conditions in a membrane bioreactor is investigated by developing and implementing a new hydrodynamic dual control system for an existing bioreactor prototype. The experimental implementation of the sensors-controllers-actuators system is complemented by the development of a transient mathematical model of the instrumented bioreactor, in which the membrane unit is treated as a three-compartment model. A four-input/seven-state transient model of the bioreactor is obtained, able to describe the time evolution of the flowrates, the extra-capillary space liquid level and the oxygen concentration across the system. The selection of appropriate sensors and the manipulated control variables is discussed. Bioreactor dynamic simulation and control is carried out within the Matlab/Simulink environment and Matlab is also used as a platform for the experimental data digital acquisition and control logic implementation (e.g. controller tuning), allowing both for flexibility with testing of different control schemes and for direct comparison of simulated and experimental values. Different experiments with selected input changes were carried out under idealized conditions and using water as perfusing medium. The applied stimuli served to mimick causes of previously observed bioreactor malfunctions (e.g. high sensitivity to liquid level variations during prolonged cell culturing experiments) and check the control system efficacy and efficiency. Finally, the developed control system is utilized during a prolonged experiment of multi-cell culture within the membrane bioreactor, demonstrating the reliable, continuous and successful cultivation for nearly one month time. The set of results collected during the present work allows to achieve new insight into the operation and reliability of bioreactors for application as bioartificial devices, by improving the capacity to predict their behaviour and better design their structure as well as by enhancing the control over the cell culture environment conditionsItem Mass and momentum transfer in membrane-based bioartificial liver systems(2017-07-11) Khakpour, Shervin; Pantano, Pietro; De Bartolo, Loredana; Curcio, EfremLiver failure, caused by acute or chronic end-stage liver disease (ESLD) imposes a significant disease burden worldwide. Chronic liver disease and cirrhosis is ranked as 12th cause of death in the United States and 4th in middle-aged adults. Researchers in Mayo Clinic report liver-related mortality as 8th by using a more comprehensive definition accounting for other aspects of liver disease as well. Currently, liver transplantation remains the conventional treatment for ESLD as the only medically proven method to promote patient’s health. To avoid the problem of inadequate donor organs and yet provide a comprehensive range of liver functions, cell-based therapies have been actively under investigation to potentially provide a substitute for transplantation, or a temporary support for liver failure patients. Studies on the latter aim has led to development of extracorporeal bioartificial liver (BAL) devices. Hepatic cell cultures are exploited for different applications in liver disease studies, drug toxicity testing, and bioartificial liver (BAL) devices. However, development of such systems is often hindered by the peculiar characteristics and intricate requirements of primary hepatocytes, challenging their prolonged functionality and viability in vitro. Despite the development of various 3D cell culture systems using perfused bioreactors, mass transfer properties still remain a critical and controversial topic, especially oxygen supply as the limiting and modulating factor The aim of this work is to enhance and optimize a prototype hollow fiber membrane bioreactor (HFMBR) providing efficient mass transfer for nutrient provision and catabolite removal, promoting prolonged viability and functionality of hepatocytes. In this bioreactor, two bundles of hollow fibers are employed in a crossed configuration: one bundle for supplying the oxygenated medium, and the other for removing the medium from the extra-capillary space. Optimization of the operational culture conditions to enforce an in vivo-like microenvironment is an intrinsic part of the process that requires a clear understanding of the in vitro cellular microenvironment. Oxygen transport in a convection-enhanced, crossed-configuration HFMBR hosting hepatocyte spheroids was investigated through mass transfer modelling using COMSOL Multiphysics®, a specialized, commercial finite-element software. The permeability of hollow fibers (hydraulic, albumin solution) was evaluated experimentally, showing significant, irreversible decrease in the permeance of the membranes due to protein absorption during culture period. Bioreactor’s hydrodynamics was investigated through residence time distribution analysis, by which a portion of the bioreactor was diagnosed as stagnant region. Finally, oxygen diffusion through the medium and the effect of different conditionings on the oxygen sensor’s readings in multi-well plates were studied. Mass transfer in static culture systems – both as a monolayer and as spheroids – was evaluated using a diffusion-reaction model numerically solved for oxygen (steady-state study) and urea (time-dependent study). In addition to the size and number of spheroids, sufficiency of oxygen supply to cells also depended on their distribution (the distance between them) and the amount of culture medium in each well. A convection-diffusion-reaction time distribution analysis, by which a portion of the bioreactor was diagnosed as stagnant region. Finally, oxygen diffusion through the medium and the effect of different conditionings on the oxygen sensor’s readings in multi-well plates were studied. Mass transfer in static culture systems – both as a monolayer and as spheroids – was evaluated using a diffusion-reaction model numerically solved for oxygen (steady-state study) and urea (time-dependent study). In addition to the size and number of spheroids, sufficiency of oxygen supply to cells also depended on their distribution (the distance between them) and the amount of culture medium in each well. A convection-diffusion-reaction time distribution analysis, by which a portion of the bioreactor was diagnosed as stagnant region. Finally, oxygen diffusion through the medium and the effect of different conditionings on the oxygen sensor’s readings in multi-well plates were studied. Mass transfer in static culture systems – both as a monolayer and as spheroids – was evaluated using a diffusion-reaction model numerically solved for oxygen (steady-state study) and urea (time-dependent study). In addition to the size and number of spheroids, sufficiency of oxygen supply to cells also depended on their distribution (the distance between them) and the amount of culture medium in each well. A convection-diffusion-reaction time distribution analysis, by which a portion of the bioreactor was diagnosed as stagnant region. Finally, oxygen diffusion through the medium and the effect of different conditionings on the oxygen sensor’s readings in multi-well plates were studied. Mass transfer in static culture systems – both as a monolayer and as spheroids – was evaluated using a diffusion-reaction model numerically solved for oxygen (steady-state study) and urea (time-dependent study). In addition to the size and number of spheroids, sufficiency of oxygen supply to cells also depended on their distribution (the distance between them) and the amount of culture medium in each well. A convection-diffusion-reaction model was developed to describe momentum and mass transfer in the bioreactor, in which the influential parameters were parametrized through implementation of applicable correlations. The model was numerically solved for two different types of geometries: (i) single-spheroid model using a periodic/symmetric unit cell within the bioreactor to locally represent the system decreasing the computational complexity of the model, (ii) miniaturized bioreactor model. The single-spheroid model was used to carry out a systematic parametric study to evaluate the effect of different parameters – oxygen tension (Co,sat), perfusion rate (QBR), hollow fiber spacing (δHF), spheroid diameter (Dsph), Michaelis-Menten kinetics for oxygen uptake (Vmax, Km) and porosities of the spheroid (εcc) and the membrane (εm) – on dissolved oxygen concentration (DOC) profile. Dimensionless numbers were defined for in-depth analysis of oxygen transfer and how each parameter can affect that. Among the operational conditions, Co,sat was found much more influential than QBR. Due to the mild advection added, the extra-spheroid resistances to diffusive mass transfer, i.e. the membrane (governed by εm) remains an important factor. However, εcc was found as a key intrinsic property strongly affecting intra-spheroid DOC profile. Maintaining physiological DOC range in large spheroids (Dsph=400μm) with different porosities was investigated in the single-spheroid model. Regulation of DOC profile was more manageable in spheroids with higher εcc, which lead to feasibility of achieving physiological oxygen concentrations. Low-porosity spheroids demonstrated a sharper concentration gradient, challenging sufficient oxygen supply to cells. Temporal shrinkage of spheroids due to rearrangement of cells changes the microstructure of the spheroid, the effect of which was numerically studied and proved to adversely affect the transport properties and consequently the DOC profile inside the spheroid. In the end, values from an experimental study were incorporated into the model to analyze the cellular microenvironment during the experiment, and the predictive capacity of the model regarding the outcome. Miniaturized bioreactor model was developed to reduce the computational cost while providing a more realistic model for the bioreactor. Another major advantage of this approach is capacitating investigation of the fluid dynamics inside the bioreactor. Notable DOC drop along the lumina of the supplying bundle was observed, consistent with the DOC gradient in the extra-capillary space along the supplying bundle. Having retentate flow in the hollow fibers significantly reduced these gradients and improved oxygen supply to the cells. Oxygen transfer was not noticeably affected by different flow patterns realized through using both bundles supplying or both removing the medium. However, minimization of the stagnant region had in fact a negative influence on oxygen supply. The miniaturized bioreactor model was also modified based on the experimental results for comparison with the single-spheroid model and the actual bioreactor, showing better compatibility with the real case.Item Performance of hollow fiber membrane bioreactor as a bioartificial liver(2017-07-11) Magdy Ahmed, Haysam Mohamed; Pantano, Pietro; De Bartolo, Loredana; Curcio, EfremC'è una crescente necessità di sviluppare un dispositivo bioartificiale di tipo epatico da utilizzare sia in applicazioni in vitro, per la sperimentazione della tossicità di molecole da parte delle aziende farmaceutiche, e sia in applicazioni cliniche per supportare pazienti con insufficienza epatica in attesa di trapianto di organo. A tale scopo è stato realizzato un bioreattore a membrana a fibre cave incrociate adoperante cellule epatiche umane in grado di favorire il mantenimento a lungo termine di epatociti. Il bioreattore è costituito da due fasci di membrane a fibre cave (HFM), uno deputato all’alimentazione e l’altro alla rimozione di cataboliti e prodotti specifici cellulari. I due fasci di fibre sono assemblati in una configurazione incrociata ed alternata in modo da stabilire una distanza l’una dall’altra di 250 μm. Questa configurazione del bioreattore delinea tre compartimenti separati: due compartimenti all’interno del lumen delle fibre cave dove il mezzo di coltura fluisce e un compartimento extraluminale dove le cellule sono coltivate. I compartimenti intraluminali ed extraluminale comunicano tra di loro attraverso i pori della parete di membrana. Il mezzo che fluisce nel lumen delle fibre di alimentazione permea nel compartimento cellulare, dove i cataboliti ed i metaboliti prodotti dalle cellule vengono rimossi dalle fibre cave deputate all’allontanamento dei molecole di sintesi e di scarto cellulari. In questo dispositivo le membrane a fibre cave consentono la compartimentalizzazione delle cellule in un microambiente controllato a livello molecolare ed il trasporto selettivo di molecole verso e dal compartimento cellulare proteggendo le cellule da eventuali sforzi di taglio. Inoltre, le membrane, grazie alla loro geometria intrinseca, offrono un'ampia superficie per l'adesione e la crescita delle cellule in un volume ridotto. Epatociti umani rappresentano una fonte cellulare ottimale da utilizzare nelle terapie che sono basate sull’uso di cellule, in quanto riflettono più da vicino le condizioni in vivo. In vivo gli epatociti sono altamente proliferativi all'interno del loro microambiente. Tuttavia, quando sono isolati dal loro microambiente e coltivati in vitro, perdono rapidamente le loro funzioni specifiche. Pertanto, è di importanza fondamentale la realizzazione di modelli in vitro in grado di mantenere gli epatociti vitali e funzionali per lungo tempo. Un aspetto critico è la la scarsa disponibilità di epatociti umani per cui occorre prendere in considerazione fonti cellulari alternative. Gli studi effettuati in questi ultimi anni indicano come una delle migliori fonti cellulari alternativa agli epatociti le cellule staminali, poiché queste cellule sono ampiamente disponibili possiedono in vitro un’elevata capacità proliferativa e possono essere differenziate in epatociti. A differenza delle cellule provenienti da animali e delle linee cellulari, le cellule staminali non costituiscono un rischio di trasmissione virale zoonotica o tumorigenicità. In questo lavoro, il bioreattore a membrana è stato ottimizzato al fine di creare condizioni di coltura per aggregati cellulari come sferoidi e per sistemi organotipici tridimensionali (co-coltura di epatociti e cellule non parenchimali) che garantiscano il mantenimento a lungo termine della funzionalità dei costrutti epatici umani. A tal proposito, le funzioni specifiche epatiche come l'urea, la sintesi dell'albumina e la biotrasformazione di farmaci sono state valutate nel bioreattore. I cambiamenti morfologici cellulari sono stati analizzati utilizzando il microscopio elettronico a scansione ed il microscopio confocale a scansione laser. Inoltre, il consumo di ossigeno delle cellule poste in coltura nel bioreattore è stato continuamente monitorato nel tempo al fine di assicurare un adeguato approvvigionamento di ossigeno. Gli sferoidi epatici umani, posti in coltura nello spazio extracapillare del bioreattore sono andati incontro ad un processo di fusione che ha portato alla formazione di strutture di maggiore dimensione simili a microtessuti. La fusione degli sferoidi è stata osservata sia tra le fibre che intorno alle fibre simulando il processo che avviene in vivo. Questo modello di coltura, grazie alle sue caratteristiche tridimensionali e all'aumentata interazione cellulare, così come avviene in vivo, ha favorito il mantenimento a lungo termine della vitalità e delle diverse funzioni specifiche epatiche come la sintesi di albumina ed urea ed il metabolismo xenobiotico. Allo stesso modo, nel sistema organotipico, le cellule si riorganizzano formando strutture tissutali simili a quelle del tessuto epatico in vivo. Questo è stato reso possibile grazie al piastramento sequenziale sulle membrane di cellule non parenchimali e parenchimali che hanno formato strutture stratificate tridimensionali simili a quelli in vivo. Il bioreattore che è stato ottimizzato in questo lavoro di tesi fornisce un microambiente di coltura ben controllato da un punto di vista molecolare attraverso l'alimentazione continua di sostanze nutritive, di cui una delle più importanti è l'ossigeno, e la rimozione di cataboliti. Ciò è stato confermato dai risultati relativi alla misura della concentrazione di ossigeno nel mezzo di coltura sia nella corrente in ingresso che in uscita dal bioreattore. In entrambi i modelli di coltura, l'approvvigionamento di ossigeno nel bioreattore è risultato essere sufficiente e significativamente maggiore a quello osservato in condizioni di coltura statica. Inoltre, una nuova fonte di cellule staminali, ovvero le cellule staminali mesenchimali derivate dal fegato, è stata utilizzata: le cellule sono state differenziate con successo in epatociti dopo 24 giorni di coltura, sia nel sistema statico che nel bioreattore. Tuttavia, il bioreattore ha mostrato una migliore capacità di mantenere la vitalità delle cellule e di differenziare le cellule staminali mesenchimalinel fenotipo epatico, come dimostrato dall'aumento dell'espressione genica di marcatori epatici specifici (ad es. albumina ed il fattore nucleare epatico alfa-4) e dalle velocità di sintesi di urea e albumina. Il prototipo di bioreattore realizzato su scala di laboratorio ha mantenuto con successo e funzionalmente attivi gli epatociti umani coltivati come sferoidi e in co-coltura con cellule non parenchimali per quasi un mese. Un aspetto importante è stato il differenziamento epatico delle cellule staminali mesenchimali, che rappresentano una potenziale fonte di cellule alternativa agli epatociti umani primari. Tutti questi risultati sono stati ottenuti utilizzando solo cellule umane, che convalidano le prestazioni del dispositivo che è stato sviluppato come sistema epatico bioartificiale da utilizzare in vitro. Questo bioreattore su scala di laboratorio ha un elevato potenziale applicativo cha va dagli studi in vitro delle malattie epatiche agli studi di tossicità a lungo termine. Inoltre, può essere realizzato su scala clinica ed applicato come fegato biartificiale per sostituire le funzioni epatiche di pazienti affetti da insufficienza epatica in attesa di trapianto.Item Biodegradable polymeric membrane systems for tissue engineering applications(2013-11-12) Messina, Antonietta; De Bartolo, Loredana; Curcio, Efrem; Molinari, RaffaeleItem Realizzazione di membrane polimeriche innovative per la crescita in vitro di tessuti umani(2010-11-12) Campana, Carla; De Bartolo, Loredana; Curcio, EfremItem Engineering membrane biohybrid system for hippocampal neuronal cells culture(2008-11-17) Rende, Maria; Drioli, Enrico; De Bartolo, Loredana; Molinari, RaffaeleL’obiettivo di questo lavoro di tesi è stato lo sviluppo di un sistema bioidrido a membrana, come modello di ricostruzione in vitro di tessuti neuronali per lo studio dei meccanismi di autogenerazione su differenti substrati. Le membrane polimeriche semipermeabili, per le loro caratteristiche di separazione, immunoprotezione e di matrice artificiale possono essere adoperate per la ricostruzione dei tessuti e organi in vitro. La disponibilità di membrane in diverse configurazioni e in diverso materiale polimerico ha reso sempre più attraente e interessante il loro impiego nello sviluppo di nuovi tessuti nel settore biomedicale e diagnostico. Oggigiorno, le membrane possono essere usate per lo sviluppo di organi bioartificiali e per la ricostruzione di nuovi tessuti. Nonostante il crescente miglioramento ed i continui progressi delle tecnologie biomediche, la sostituzione di organi danneggiati da traumi e/o malattie rappresenta un problema cruciale per la moderna medicina. Le terapie attualmente in uso non solo sono estremamente costose, ma spesso non sono in grado di soddisfare pienamente gli scopi per i quali vengono applicate; il trapianto d’organi è severamente limitato dall’insufficienza dei donatori e dai problemi di compatibilità. Il superamento di queste difficoltà sembra sia possibile grazie ai continui sviluppi ottenuti in un settore di ricerca, emerso di recente nel campo delle scienze dei biomateriali, l’ingegneria tissutale o tissue engineering. In tale ambito, sono state messe a punto tecniche che permettono di coltivare in laboratorio linee cellulari e tessuti con le caratteristiche del ricevente [De Bartolo et al., 2007]. In vivo, le cellule sono supportate da una matrice extracellulare che influenza la loro morfologia, proliferazione e differenziazione nonché la loro funzione metabolica. Quando le cellule sono coltivate in vitro, un simile supporto meccanico e chimico deve essere fornito dall’ambiente di coltura, per questo motivo è molto importante conoscere le proprietà di membrana (chimico-fisiche, strutturali e di trasporto), che possono influenzare le funzioni che la membrana svolge e soprattutto la compatibilità del materiale polimerico a contatto con le cellule e i fluidi del corpo. Le cellule ed i tessuti Abstract 2 ottenuti in vitro sono poi innestati nel paziente, ripristinando le funzionalità compromesse, senza dover ricorrere al trapianto di elementi biologici prelevati da donatori estranei. I tessuti ingegnerizzati, in caso di successo, si integrano con quelli del paziente, apportando in tal modo un contributo specifico e duraturo alla cura dello stato patologico, senza richiedere debilitanti e costosi trattamenti farmacologici. In questa logica, la tecnologia è interessata allo sviluppo e alla produzione di nuovi sistemi per la coltura in vitro di cellule su larga scala, con particolare attenzione al controllo dei fenomeni e delle condizioni operative che regolano il trasporto dei nutrienti e dei prodotti di scarto del metabolismo cellulare. A tale proposito, numerosi studi sono stati condotti negli ultimi anni riguardo la possibilità di sviluppare sistemi artificiali basati sull’utilizzo di biomateriali, scaffolds e cellule, che consentano la sostituzione di tessuto nervoso danneggiato o permettano di ripristinarne l’organizzazione strutturale e anatomica e, conseguentemente, le capacità funzionali [Lee et al., 2003; Schmalenberg et al., 2005]. Tra i biomateriali impiegati nel campo della tissue engineering, le membrane polimeriche semipermeabili sembrano fornire il supporto meccanico e chimico necessario a garantire la regolazione del processo di crescita e di differenziamento delle cellule neuronali in sistemi bioibridi: le interazioni cellula-substrato inducono risposte cellulari specifiche, consentendo ai neuroni di assumere un definito orientamento nello spazio e la formazione in vitro di un ricco network di connessioni sinaptiche. Un sistema bioibrido a membrana adoperante cellule neuronali potrebbe, dunque, costituire un valido strumento nel campo dell’ingegneria tissutale, per consentire lo studio dei meccanismi molecolari alla base di malattie neurodegenerative e nello sviluppo di bio-molecole da impiegare nella terapia farmacologia, per consentire di ripristinare le funzionalità danneggiate [Simonin et al., 2006]. Lo stato dell’arte riguardante la coltura di cellule neuronali su matrici sintetiche, racchiude per la maggior parte lavori che riguardano la coltura di cellule tumorali, come linee immortalizzate. Tuttavia queste cellule hanno un metabolismo che risulta essere diverso dalle cellule primarie; di conseguenza le informazioni che si ottengono non possono essere trasportate completamente alla situazione in vivo. Sono molti i casi in cui, per l’espansione in vitro di cellule neuronali, vengono utilizzate altre cellule di sostegno (glia, astrociti), allo scopo di supportare la crescita delle cellule di interesse (cocoltura). La cocoltura risultante può avere molti vantaggi rispetto alla coltura pura, in quando le cellule neuronali, ricevono naturalmente le sostanze necessarie per la crescita dalle cellule che in condizioni naturali fungono da sostegno. Dallo studio di lavori su neuroni ippocampali, è possibile evidenziare che nella maggiorparte dei casi, sono stati valutati gli effetti del substrato sulle cellule, per pochi giorni di coltura (4-5 giorni); al contrario, è proprio dal 4° al 8° giorno di coltura che le cellule neuronali ippocampali, dopo la prima fase di adesione, iniziano a crescere aumentando i prolungamenti assonici e dendritici ed esplorando così l’ambiente circostante. L’adesione è importante nelle prime ore di coltura, perché indica la presenza di una buona superficie di attacco, cioè di una buona compatibilità del supporto, ma la differenziazione e vitalità a lungo termine può essere valutata solo allungando il periodo di osservazione della coltura oltre il 4° giorno. Durante la prima fase di crescita la cellula neuronale, essendo totipotente, riesce ad adattarsi all’ambiente circostante differenziandosi, grazie anche alla presenza di molecole importanti per la crescita nel mezzo di coltura. Solo successivamente alla formazione del network, si vengono a formare degli scambi molecolari con l’ambiente circostante, importanti per il mantenimento della vitalità e funzionalità cellulare a lungo termine. L’ippocampo è un particolare zona del cervello che ha funzione di apprendimento e di memoria, risulta essere associata alla motivazione, al controllo delle emozioni, alla memoria e, oltretutto gioca un importante ruolo nel controllo delle risposte dell'organismo allo stress. Questa caratteristica plasticità è molto interessante soprattutto in caso di patologie come l’Alzahimer o in altre malattie degenerative, oppure nel coma. Lesioni provocate all’ippocampo danno luogo a disturbi della memoria e dell’apprendimento piuttosto intensi. Sono stati testati su cavie, diversi farmaci che migliorano le funzioni cognitive in caso di danni cerebrali, ma i risultati sono modesti e a volte i farmaci risultano nocivi. Attualmente esistono evidenze sperimentali che i fattori ambientali giocano un ruolo fondamentale nel recupero delle capacità cognitive.Essendo il numero di cellule neuronali stabilito alla nascita, e non variabile in quando i neuroni non hanno capacità di dividersi e proliferare, nasce l’esigenza di studiare i meccanismi di autogenerazione dei tessuti allo scopo di superare queste patologie e disturbi post-traumatici molto diffusi nella popolazione. L’obiettivo di questo lavoro di tesi sperimentale è stato rivolto alla possibilità di realizzare sistemi bioibridi a membrana per la coltura di neuroni, isolati da una regione cerebrale coinvolta in importanti funzioni neurofisiologiche, quali l’apprendimento e la memoria: l’ippocampo. Numerosi lavori riportano l’utilizzo di tale regione cerebrale per gli studi neurobiologici e funzionali, valutando non solo stadi di sviluppo critici in vivo ed in vitro [Fukata et al., 2002], ma anche i meccanismi cellulari che sono alla base di svariate patologie neurodegenerative quali l’epilessia [Ullal et al., 2005]. Inoltre i neuroni ippocampali hanno una forma ben definita, facilmente monitorabili in vitro anche per lunghi periodi di coltura [Bunker and Goslin, 1998]. Il modello animale prescelto è stato l’ibernante facoltativo Mesocricetus auratus, ampiamente utilizzato negli studi neurodegenerativi, in quanto alcuni stadi di ibernazione ed in particolare il risveglio, rappresenta condizioni simil-ischemiche cui l’animale risponde con strategie di adattamento e plasticità sinaptica [Canonaco et al., 2005, 2008]. In tali sistemi la capacità delle membrane di fornire un adeguato microambiente alle cellule in coltura, dipende dalle proprietà morfologiche e chimico-fisiche della superficie di membrana e dalle proprietà di trasporto. In una prima fase è stata sviluppata una nuova membrana piana, preparata mediante inversione di fase, a partire da un blend polimerico di polyetheretherketone (PEEK-WC) modificato e poliuretano (PU). Questa membrana offre il vantaggio di combinare le proprietà di entrambi i polimeri (biocompatibilità, resistenza termica e meccanica ed elasticità) con l’elevata proprietà di permeabilità, selettività ed una ben definita geometria dei pori della membrana. La membrana di PEEK-WC-PU è stata usata per la coltura di neuroni ippocampali in un sistema bioibrido allo scopo di rigenerare il tessuto in vitro. Per dimostrare la validità del sistema sperimentale, sono state determinate il grado di interazione e differenziazione cellulare e l’attività metabolica (cosumo di glucosio produzione di lattato). I risultati preliminari mostrano la capacità di adattamento delle cellule neuronali ippocampali in coltura nel sistema bioibrido a membrana. Simile al comportamento delle cellule neuronali sulla polilisina, su questo tipo di membrana le cellule aderiscono e si differenziamento dando origine ad un complesso neuronal network. Come ulteriore conferma dell’avvenuto differziamento cellulare è stato utilizzato un marcatore cellulare specifico (MAP2), allo scopo di dimostrare l’inaterata struttura del citoscheletro delle cellule neuronali. I risultai di questo studio incoraggiano lo sviluppo di sistemi bioibridi a membrana per la coltura di neuroni ippocampali allo scopo di rimodellare e rigenerare in vitro tessuti in un microambiente controllato. Le proprietà morfologiche del substrato possono svolgere un ruolo importante nell’interazione cellulare e soprattutto nel caso di cellule neuronali possono guidare topograficamente lo sviluppo di processi assonici e dendritici. A tale scopo in una seconda fase, è stato studiato l’effetto delle proprietà morfologiche della superficie di membrana, sul differenziamento delle cellule neuronali. Membrane commerciali sia microporose di polietersulfone (PES) e poliestere (PE) e sia dense di fluorocarbone (FC) sono state caratterizzate allo scopo di definire le loro proprietà morfologiche (e.g., dimensione media dei pori, porosità, rugosità, distribuzione della dimensione dei pori) e le loro proprietà chimico-fisiche (e.g. bagnabilità, adsorbimento di acqua). Le membrane sono state modificate con coating di polilisina allo scopo di favorire l’adesione cellulare e di creare superfici con gli stessi gruppi funzionali interagenti con le cellule ed investigare solo l’affetto della morfologia di superficie sul differenziamento cellulare. Le membrane modificate sono state caratterizzate per valutare l’uniformità del coating, la rugosità della superficie e le proprietà di trasporto. Il coating ha modificato le proprietà chimico-fisiche in termini di bagnabilità, uniformando le differenze superficiali delle membrane native. Le membrane così modificate presentavano una rugosità si superficie compresa tra 6-200 nm. La modifica di superficie ha ridotto la permeanza idraulica delle membrane di poliestere e di polietereterchetone rispettivamente del 60% e del 25%, mentre per le membrane di polisulfone è rimasta invariata. Lo sviluppo ed il differenziamento delle cellule in coltura sono stati valutati in termini qualitativi, attraverso l’osservazione dei cambiamenti morfologici dei neuroni isolati e della formazione di un caratteristico network di prolungamenti assonici e dendritici sia sulle membrane di PEEK-WC che su membrane commerciali, quali PE, PES, FC. E’ stata valutata quindi la localizzazione e la distribuzione di marcatori strutturali come la β- tubulina, una proteina associata al citoscheletro, presente nel soma e in tutti i prolungamenti neuronali. Per favorire la visualizzazione dei prolungamenti assoni è stata scelta una proteina specifica di tale prolungamento e precisamente la Growth-Associated Protein-43 (GAP43). Il metabolismo delle cellule è stato valutato in termini di consumo di glucosio e produzione di lattato, presenti nel mezzo di coltura. Inoltre è stata valutata la secrezione di fattori neurotrofici come il Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), al fine di analizzare l’attività neuronale di sintesi di specifici fattori differenziativi durante lo sviluppo in vitro. E’ stato in tal modo investigato il mantenimento a lungo termine della vitalità e della funzionalità dei neuroni per un periodo di tempo di 12 giorni di coltura. La rugosità della superficie di membrana ha influenzato notevolmente l’adesione cellulare e la formazione del network meuronale sulle membrane di FC (Ra= 6nm) e di PES (Ra = 50 nm). Le cellule formano prolungamenti assonici e dendritici che si ramificano e si connettono con i prolungamenti in un network molto complesso. Al contrario in membrane più rugose come quelle di PEEK-WC (Ra= 199,2) le cellule tendono ad aggregarsi ed a formare prolungamenti che si sviluppano nei pori della membrana. Le osservazioni microscopiche sono state confermate da analisi quantitative della lunghezza assonica e del metabolismo cellulare. Sulle membrane con rugosità compresa tra 6 nm e 50 nm i prolungamenti assonici sono significativamente più lunghi rispetto alle membrane con una rugosità maggiore. Le membrane con una rugosità compresa tra 6-50 nm favoriscono la formazione di strutture neuronali polarizzate e la produzione di neurotrofine specifiche come il BDNF, che ha un ruolo nella sopravvivenza e maturazione di specifiche popolazioni neuronali nonché nella trasmissione sinaptica. Il sistema bioibrido costituito da membrane i FC e neuroni ippocampali è stato adoperato per studiare l’azione modulatrice delle sub unità α dei recettori del acido γ-Aminobutyric type A (GABA), sull’organizzazione dei processi neuronali. A tale scopo sono stati adoperati molecole che svolgono un’azione altamente agonista sulle subunità α2 e molecole che svolgono un'azione antagonista sulle subunità α5. Queste subunità grazie alla loro localizzazione sinaptica ed extrasinaptica, sono critiche per le funzioni immunogeniche associative, da cui si evince che, l’interazione tra il sistema GABAergico e il sistema Gluergico può costituire un elemento potenziale che è cruciale per regolare lo sviluppo assonale e dendritico. Successivamente sono state sviluppate membrane a fibre cave (HFMs) di PEEK-WC e di Polyacrilonitrile (PAN) allo scopo di sviluppare un sistema tridimensionale altamente integrato. Le membrane in configurazione a fibra cava sono vantaggiose rispetto alle piane poiché offrono: i) Un’ampia superficie di adesione e di scambio di nutrienti ed un volume molto piccolo; ii) una compartimentalizzazione all’inerno e all’esterno della fibra e quindi separazione del compartimento cellulare da quello ex cellulare; iii) un’adeguata perfusione evitando fenomeni di shear stress. Le HFMs sono state preparate mediante dry-wet spinning e successivamente caratterizzate allo scopo di conoscerne le proprietà chimico fisiche e di trasporto. Le proprietà di permeabilità delle membrane sono particolarmente importanti per le fibre cave per lo scambio molecolare tra il compartimento cellulare e l’ambiente esterno. Quindi è stato determinato il cut-off delle fibre di PEEK-WC e di PAN che sono rispettivamente all’incirca di 78000 Da e 81000 Da. Le membrane modificate mediante coating con PLL sono state utilizzate nella coltura a lungo termine di neuroni ippocampali. La capacità di adesione e accrescimento delle cellule è stata valutata per 12 giorni di coltura. Sulle fibre di PEEK-WC è stata osservata la formazione di un network neuronale piuttosto complesso ed omogeneamente distribuito in tutta la superficie esterna della fibra mentre sulle membrane di PAN le cellule hanno formato in diverse zone della superficie di membrana dei distretti cellulari dai quali si sviluppano i prolungamenti neuronali. Su entrambe le fibre, le cellule sono state funzionalmente attive per 12 giorni. Le fibre di PAN hanno sviluppato un maggior consumo di glucosio e produzione di lattato rispetto alle fibre di PEEK-WC. Il costrutto tissutale sviluppato ha mantenuto la sua funzionalità per 12 giorni di coltura. Le membrane in configurazione a fibra cava hanno consentito lo sviluppo di un sistema tridimensionale che da un punto di vista microarchitettonico consente di dirigere e guidare la rigenerazione neuronale in un sistema modello in vitro. Nell’ultima fase di questo lavoro è stato sviluppato un sistema bioibrido adoperando una membrana biodegradabile di chitosano. I polimeri biodegradabili sono materiali che si decompongono ma i cui prodotti di degradazione persistono a lungo nell’organismo ospitante. Spesso questo termine include le sotto classi di materiali assorbibili, riassorbibili, bioassorbibili e biodegradabili. Molti scenari di applicazione, compresa l’ingegneria tessutale, necessitano per l’utilizzo in vivo di matrici polimeriche biodegradabili o di strutture che siano minimamente soggette a interazioni con il tessuto in via di sviluppo. Lo sviluppo di queste diverse funzioni solitamente richiede una microstruttura di sostegno porosa, con caratteristiche di porosità proprie dell’applicazione specifica. Il chitosano è un polisaccaride biosintetico che è ottenuto dalla deacilazione della chitina, che è un polisaccaride naturale prodotto da un’enorme numero di organismi viventi. Il chitosano è l’unico polimero pseudonaturale caricato positivamente e questo lo rende importante per molte applicazioni biomedicali. L’adesione e la crescita delle cellule su questa membrana è stata valutata mediante osservazione della coltura nel tempo (16g) ed analisi dell’attività metabolica (cosumo di glucosio, produzione di lattato) e di sintesi (BDNF) dei neuroni ippocampali in coltura. Le cellule neuronali ippocampali in coltura sulle membrane di chitosano aderiscono e si differenziano senza necessità di modifica della superficie di membrana attraverso l’utilizzo di biomolecole come la polilisina (PLL). La morfologia della cellula sulle membrane di chitosano del tutto simile alle cellule in coltura sul substrato di controllo (costituita da PSCD rivestito di PLL), non sono presenti differenze significative nella grandezza del soma e nella lunghezza dei neuriti. L’attività metabolica delle cellule, in termini di consumo di glucosio e produzione di lattato, viene mantenuta ad alti livelli per tutto il periodo di coltura; esse inoltre esibiscono una maggiore capacità di sintesi della neurotrofina BDNF, conseguente ad un miglior grado di connessione sinaptica tra le cellule. I risultati incoraggianti rappresentano un punto di partenza per lo sviluppo successivo di sistemi biobridi a membrane e biodegradabili in impianti tissutali e nella riparazione di tessuti. I risultati ottenuti rappresentano un primo approccio nella realizzazione di sistemi bioibridi che consentono una coltura di tipo tridimensionale e quindi paragonabile a quella in vivo. Tali sistemi, adoperanti neuroni ippocampali, possono essere utilizzati nello studio, in vitro, del comportamento morfologico e funzionale di popolazioni neuronali danneggiate in alcune delle più comuni malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer e l’epilessia [Ullal et al., 2005; Cotel et al., 2008].