Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione - Tesi di Dottorato

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Questa collezione raccoglie le Tesi di Dottorato afferenti al Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione dell'Università della Calabria.

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    The multiple roles of dopamine D2 receptors in health and disease
    (2006-11-27) Emanuele Tirotta, Emanuele Tirotta; Andò, Sebastiano; Lanzino, Marilena; Borrelli, Emiliana
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    Nuove strategie per la sintesi di peptidi e steroidi modificati
    (2007-11-16) Perri, Francesca; Loiguori, Angelo; Gabriele, Bartolo
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    Mechanisms of RA action in steroidogenic tissues and pro-apoptotic effects of combined treatment of breast tumoral cell lines with 9-cis retinoic acid and rosiglitazione
    (2008-11-20) Pingitore, Attilio; Bonofiglio, Daniela; Sisci, Diego
    Vitamin A (Retinol) plays a central role in many essential biological processes such as vision, immunity, reproduction, growth, development, control of cellular proliferation and differentiation. The main active forms of retinol, not primary involved in vision, are alltrans retinoic acid and 9-cis retinoic acid, both able to act at nuclear level by binding their receptors RAR and RXR and modulating many physiological processes. However, the nuclear action of vitamin A derivatives is not the only mechanism of retinoic acid (RA) acting on cells. RA is able to modify covalently proteins via a post-translational modification, named retinoylation that has been shown to occur at physiological concentration on pre-existing proteins and localized mainly in the mitochondrial compartment. The present study has been focused on the non genomic action of RA on steroidogenic tissues, testes and adrenal glands, giving further details on the ability of RA to influence protein activity and therefore cell physiology. In particular RA effects on mitochondria from the adrenal glands and the 2-oxoglutarate carrier protein from testes and TM-3 Leydig cell line were studied, providing new data on the peculiarity of steroidogenic tissues to incorporate RA at dietary levels and demonstrating how the shuttling of reducing equivalent across the mitochondrial membrane is influenced by RA treatment. Looking for the biochemical mechanism of RA action on the Adenine Nucleotide Translocator, that exchanges ATP for ADP between mitochondria and cytosol, for the first time, it was possible to demonstrate how the activity of this carrier protein is positively modulated by the Coenzyme A, a fundamental component of the retynoilating buffer. At pharmacological levels, retinoids are also active compounds in the treatment of cancer due to the capability to promote cell differentiation and their pro-apoptotic activity. In this latter concern, the mechanisms of nutriceutical concentration of 9-cis RA, together with nanomolar concentration of the selective PPARγ ligand, rosiglitazone, to promote apoptosis in breast cancer cell lines, have been investigated. The data lay the basis for a potential use of the combined therapy with low doses of both BRL and 9-cis RA as novel therapeutic tool particularly for breast cancer patients who develop resistance to antiestrogen therapy
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    Ruolo del pathway trasduzionale dell'ossido nitrico (NO) nella regolazione umorale dell'attività cardiaca
    (2008-11-22) Filice, Elisabetta; Sisci, Diego; Cerra, Maria Carmela
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    Molecular mechanism of PPARγ mediated apoptosis in different cancer celles
    (2008-11-26) Qi, Hongyan; Sisci, Diego; Bonofiglio, Daniela
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    Il trasportatore di carnitina OCTN2: espressione ed implicazioni fisiopatologiche
    (2010) Scalise, Mariafrancesca; Indiveri, Cesare; Sisci, Diego
    In the present work we studied the plasma membrane transporter of carnitine OCTN2. We firstly investigated the interaction of this transporter with a commonly used drug, the omeprazolo. The carnitine transporter was solubilized from rat renal apical plasma membrane (brush-border membrane) with C12E8 and reconstituted into liposomes removing the detergent from mixed micelles by hydrophobic chromatography on Amberlite XAD-4. The reconstituted carnitine transporter catalysed a first-order antiport reaction of carnitine with itself or other substrates stimulated by external, not internal, Na+, with a positive cooperativity. Na+ was co-transported with carnitine. The transporter is asymmetrical and it is unidirectionally inserted into the proteoliposomal membrane with an orientation corresponding to that of the native membrane. Omeprazole externally added to the proteoliposomes, inhibited the carnitine/carnitine antiport catalysed by the reconstituted transporter. The inhibition was reversed by the treatment of the proteoliposomes by DTE indicating that the inhibition was caused by the formation of omeprazole-transporter mixed disulphide. However, omeprazole caused inhibition of the transport also in the presence of DTE, indicating a second inhibition mechanism of non-covalent nature. The presence of the substrate during the incubation of the omeprazole with the proteoliposomes increased the formation of the mixed-disulphide. Omeprazole did not inhibited when present in the internal proteoliposomal compartment, indicating that the inhibition was specifically due to interaction with the external residues or sites of the protein. Omeprazole was not found to be transported by OCTN2: the structure of the activated form of omeprazole, indeed, possess a charged pyridine group and a methoxyl oxygen at a reciprocal distance of three carbon atoms which fulfil the requirement for interaction with the active site and inhibition but not for transport. The implication of the two mechanism of inhibition of the carnitine transporter in physiopathology may be relevant in the light of the omeprazole concentration reached in the blood after administration: the inhibition by omeprazole, indeed, may lead to a carnitine deficiency-like syndrome more or less evident, depending on the dose and on the individual capacity of metabolizing the drug. In the present work we studied, also, the human isoform of OCTN2: (i) we obtained the heterologous over-expression and the purification of hOCTN2 in a bacterial host, E. coli and (ii) we evaluated the expression profile of hOCTN2 in different cancer cell lines and in keratinocytes retrotransduced with HPV16 E6E7. The cDNA coding for hOCTN2 was cloned in two bacterial expression vector and, following two different strategies, we over-expressed the hOCTN2 protein as fusion protein with GST and as hOCTN2 without any tag but with codon bias. In both cases the protein was present in the insoluble fraction of induced lysate and was, then, solubilized with a ionic detergent, Sarkosyl, together with chaotropic agent, Urea. After solubilization the protein was purified on Nichel-chelating chromatography column, obtaining the protein solubilized in Triton X- 100. In the present work we described the expression profile of hOCTN2 in different cancer cell lines and in keratinocytes immortalized by HPV16E6E7: we observed a down-regulation at mRNA levels of hOCTN2 which was reversed by treating cells with 5-aza-cytidine a DNA demetilating agent. Cells over- expressing hOCTN2 were more sensitive to the chemotherapic agent cisplatin. This observation is a preliminary result suggesting a potential role of hOCTN2 in carcinogenesis or in cancer development.
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    Dynamic effects of retinoic acid and its isomers on cancer and physiology
    (2010-11-23) Perri, Mariarita; Bonofiglio, Daniela; Sisci, Diego
    In the search for new cancer chemo-preventive compounds, hundreds of naturally occurring molecules have been evaluated. Among these, antioxidants appear to be very promising. In this contest, over the last decade retinoids, natural and synthetic substances structurally related to vitamin A, are often used as part of a combined therapy and have been object of intense investigation. However, clinical trials have shown that retinoids can also be deleterious and are associated with the activation of proto-oncogenes, leading to an increased incidence of neoplasias. In fact, retinoic acid (RA) partition is regulated by cognate intracellular lipid binding proteins (iLBPs): cellular retinoic acid binding protein II (CRABP-II) delivers RA to RARs, while fatty acid binding protein 5 (FABP5) shuttles the RA to PPARβ/δ. In cells with high CRABP-II/FABP5 ratio, RA functions through RAR acting as a pro-apoptotic agent, while signaling through PPARβ/δ promotes survival in those cells highly expressing FABP5. So that, in some tissues RA promotes cell survival and hyperplasia. The apparently conflicting data regarding the pro-oxidant/ anti-oxidant and proliferative/anti-proliferative potential of different retinoids molecules, stimulated us to investigate the effect of RA on cell proliferation and its mechanisms in two different tumor Leydig cell lines (MLTC-1 and R2C) using as normal phenotype counterpart the Leydig TM-3 cell line. Our previous data demonstrated how pharmacological doses of RA induce cell death via the apoptotic pathway in Leydic TM-3 cell line. Recently dose-response treatment of TM-3, MLTC-1 and R2C with RA at nutraceutic/physiological doses, promotes cell proliferation accompanied by stimulation of antioxidant enzymes activity (CAT, GST), decreases p21 levels and fosters cell cycle progression via activation of the IP3K/Akt pathway in the cancer cell line, while administration of pharmacological doses of RA still results in apoptosis. Interestingly treatment with 500 nM of RA resulted in cytosolic vacuolization, hallmark of the autophagic process. Autophagy is a major cellular pathway for the degradation of long-lived proteins and organelles in eukaryotic cells. A large number of intracellular/extracellular stimuli, including amino acid starvation, testosterone production and invasion of microorganisms are able to induce autophagic response. In addition, retinoic acid is also implicated in a post-translation modification called retinoylation that modify, in vitro, the activity of the mitochondrial carrier oxo-chetoglutarate (OCG). Moreover, retinoids are often used as part of a combined therapy, their action is prevalently mediated by two types of receptor RAR and RXR. This latter, is also called master coordinator due to its versatility to heterodimering with several nuclear receptor. Thus, we have elucidated the molecular mechanism by which combined treatment with rosiglitazone (BRL) and 9 cis retinoic acid (9cRA) at nanomolar doses triggers apoptotic events in breast cancer cells, suggesting potential therapeutic uses for these compounds, demonstrating an up-regulation of tumor suppressor gene p53 and its activity is due to the NFkB site, giving emphasis to the potential use of the combined therapy with low doses of both BRL and 9cRA as novel therapeutic tool particularly for breast cancer patients who develop resistance to anti-estrogen therapy. Recently, 9cRA was found as endogenous in pancreas highlighted its rule in both glucose stimulated insulin secretion (GSIS) mechanism and glucose homeostasis, establishing it as autocoid hormone with a unique physiological function among retinoids, and broaden insight into mechanisms of GSIS
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    Chenodeoxycholic acid (CDCA) through TGR5-dependent CREB-signaling activation enhances Cyclin D1 expression and promotes human endometrial cancer cell proliferation
    (2011) Avena, Paola; Casaburi, Ivan; Sisci, Diego
    Increasing epidemiologic data in humans as well as many in vitro investigative reports suggest that overweight and obesity are important risk factors for type-I EC which is the most common malignancy in women and accounts for 80% of all ECs. The strongest support for mechanisms to link obesity and cancer risk involves the metabolic and endocrine effects of obesity and the alterations that they induce in the production of peptide and steroid hormones. One way in which fat might exert its effect is stimulation of bile acids (BAs) synthesis and secretion. Bile acids (BAs) are amphipathic detergents that are synthesized in the liver and stored in the gallbladder. An important physiological role of BAs is to facilitate the uptake of lipids together with the fat-soluble vitamins A, D, E and K from the intestine. BAs facilitate these absorptive processes through their detergent properties, which allow the emulsification of lipids. Moreover, BAs have evolved over the past few years from being considered as simple lipid solubilizers to complex metabolic integrators. Beyond the orchestration of bile acids, lipid and glucose metabolism by the nuclear receptor farnesoid X receptor (FXR), BAs also act as signaling molecules through the non-genomic pathway activated by a BAdedicated G protein-coupled receptor (GPCR) TGR5 (also known as BG37 or MBAR). Despite the efficient enterohepatic recirculation of bile acids, a small amount of them can spill over into the systemic circulation particularly during high fat diet. Since in the obese women a strong correlation with endometrial cancer does exist, we investigated the biological effects of different concentrations of the primary bile acid CDCA in a human endometrial type-I cancer cell line, Ishikawa. Ishikawa cell proliferation was determined by [3H]-thymidine incorporation assay after 72 hours of treatment with different concentrations of CDCA. The effects of CDCA on the expression of the cell cycle regulatory proteins were evaluated by RT-PCR and Western blotting assays. Transient transfection method and mutagenesis studies were performed to functionally characterize the Cyclin D1 promoter while ChIP assay was to highlight the direct involvement of the ciselements in CDCA-dependent Cyclin D1 up-regulation. In addition, the effects of impaired expression and function of the proteins involved in CDCA activated signaling were assessed by using small interfering RNAs (siRNAs) technology. Our results indicate that low concentrations (< 30μM) of CDCA were able to stimulate Ishikawa cell growth as evidenced by [3H]Thymidine incorporation and cell cycle analysis by inducing a significant increase in Cyclin D1(CD1) protein and mRNA expression. In contrast, according to previous findings, high doses (> 50μ) of CDCA showed cytotoxic effects concomitantly with an increase of CDK inhibitor p21WAF1/CIP1 expression through a p53-indipendent pathway. Moreover, mutagenesis studies and ChIP analysis revealed that the CDCA-induced CD1 expression requires a cyclic AMP-responsive element (CRE) binding protein motif within the CD1 proximal promoter. Silencing of a cell surface bile acid sensor TGR5 and/or CREB gene expression by RNA interference reversed the CDCA-dependent induction of CD1 expression and proliferation in Ishikawa cells. In conclusion, extrahepatic spillover of BAs following high fat diet particularly in overweight and obese women, could be involved in the onset and/or maintenance of endometrial cancer by stimulation of TGR5 that activates ERK signaling that in turn induces the recruitment of the transcription factor CREB to the Cyclin D1 gene promoter enhancing cell proliferation
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    Molecular Mechanisms of FXR-mediated Growth Inhibition in Hormone-dependent Cancers
    (2011) Panza, Salvatore; Sisci, Diego; Catalano, Stefania
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    Caratterizzazione del ruolo dell'autofagia in un modello sperimentale di glaucoma acuto
    (2011) Varano, Giuseppe Pasquale; Sisci, Diego; Russo, Rossella
    Il termine glaucoma indica un gruppo eterogeneo di neuropatie ottiche progressive caratterizzate da alterazioni del campo visivo dovute alla morte delle cellule ganglionari retiniche (Retinal Ganglion Cells, RGCs) e alla degenerazione del nervo ottico. Le strutture interessate in corso di glaucoma, retina e nervo ottico, costituiscono parte del sistema nervoso centrale (SNC), pertanto, il glaucoma è considerato, sotto ogni aspetto, una malattia neurodegenerativa. Così come per molte altre patologie neurodegenerative, l’eziologia del glaucoma è complessa e multifattoriale e la fisiopatologia cellulare e molecolare rimane poco sconosciuta. L’aumento della pressione intraoculare è considerato il principale fattore di rischio associato alla patologia, sebbene non sia la condizione necessaria e sufficiente per l'insorgenza della malattia e le cause responsabili della morte delle cellule ganglionari retiniche rimangono ancora ignote. Tuttavia, diversi sono i fattori che possono essere coinvolti per spiegare la perdita delle cellule ganglionari retiniche, fra questi: la deprivazione di fattori trofici, il danno da ischemia-riperfusione, lo stress ossidativo, la disfunzione mitocondriale e l’eccitotossicità indotta dal glutammato. Il processo autofagico rappresenta il principale sistema di degradazione lisosomiale per il turnover di organelli e di proteine a lunga emivita. Questo processo permette alla cellula di eliminare componenti tossici o danneggiati allo scopo di mantenere i livelli energetici e l’omeostasi cellulare in condizioni di stress metabolico. Un crescente numero di evidenze sperimentali suggerisce che la disfunzione o la deregolazione autofagica è associata a diverse patologie neurodegenerative di tipo cronico, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington, ma anche di tipo acuto, come il danno ipossico e ischemico. Tuttavia, nonostante i numerosi studi sul ruolo dell’autofagia nelle malattie neurodegenerative, il ruolo di tale processo nella degenerazione retinica rimane ancora poco studiato. Pertanto, gli obiettivi del presente lavoro di ricerca sono stati: - verificare la modulazione del processo autofagico in un modello sperimentale di glaucoma in vivo ottenuto attraverso l’aumento transitorio della pressione intraoculare con conseguente ischemia retinica. - valutare il ruolo dell’autofagia sulla vitalità cellulare in colture di cellule ganglionari retiniche RGC-5 attraverso la manipolazione farmacologica ed il silenziamento genico di proteine tipicamente coinvolte nel processo autofagico I risultati ottenuti dimostrano che l’insulto ischemico induce una riduzione significativa dell’espressione della forma associata all’autofagosoma della proteina LC3 (LC3II) e della proteina Beclin-1, coinvolta nelle fasi iniziali del processo autofagico. Quest’ultimo evento è accompagnato dal clivaggio proteolitico della proteina Beclin-1 nella fase post-ischemica con accumulo di un frammento proteico di 50kDa. L’attivazione della cascata eccitotossica, che consegue all’eccessiva stimolazione dei recettori NMDA per il glutammato, caratterizza l’insulto ischemico retinico e la morte delle cellule ganglionari ad esso associata. Nel presente lavoro è stata studiata l’attivazione delle proteasi Ca2+-dipendenti calpaine, tipicamente associate al fenomeno eccitotossico, in seguito all’induzione dell’ischemia retinica. Il profilo temporale di attivazione di questi enzimi proteolitici mostra un andamento compatibile con un loro coinvolgimento nel clivaggio della proteina Beclin-1. Il trattamento con l’antagonista non competitivo dei recettori NMDA del glutammato, l’MK- 801 (50nM, 5μl/occhio), con gli inibitori delle calpaine MDL28170 ed SJA6017 (1mM, 3μl/occhio) ed il silenziamento genico della subunità-1 delle calpaine in vivo (CAPNS1- siRNA, 10μg/occhio), mentre riducono l’attività delle proteasi, prevengono l’accumulo del frammento di 50kDa. L’insieme dei dati conferma il coinvolgimento delle calpaine nel clivaggio di Beclin-1, che viene pertanto identificata come un nuovo substrato di queste proteasi. Infine, il ruolo protettivo o detrimentale dell’autofagia è stato valutato in colture cellulari RGC-5 in vitro. La deprivazione da siero per un periodo di 24h induce l’attivazione dell’autofagia; il trattamento con gli inibitori del processo autofagico, Bafilomicina-A1 (100nM) e 3-metil-adenina (10mM), ed il silenziamento genico della proteina Beclin-1 in vitro riducono in modo significativo la vitalità delle RGC-5 in condizioni di deprivazione da siero. In conclusione, i dati riportati in questo studio indicano una deregolazione dell’autofagia in seguito all’ischemia/riperfusione retinica associata al clivaggio, mediato dalle calpaine, della proteina Beclin-1 e supportano il ruolo neuroprotettivo di questo processo nelle cellule ganglionari retiniche. Pertanto, la regolazione del processo autofagico potrebbe rappresentare un aspetto importante nelle patologie oculari associate ad eventi ischemici e quindi un potenziale bersaglio per nuove strategie neuroprotettive.
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    PPARγ ligands as novel agents able to inhibit breast tumor growth and progression
    (2011) Vizza, Donatella; Sisci, Diego; Bonofiglio, Daniela
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    Cratterizzazione degli effetti neuroprotettivi della leptina in un modello sperimentale di ischemia cerebrale focale nel ratto
    (2011) Petrelli, Francesco; Sisci, Diego; Amantea, Diana
    La leptina, oltre ad avere effetti sull’ipotalamo per il controllo del peso corporeo, è coinvolta nella regolazione della funzionalità, dello sviluppo e della sopravvivenza neuronale. Studi recenti hanno evidenziato i suoi effetti neuroprotettivi nel danno ischemico cerebrale, ma fino ad oggi il ruolo del fattore di trasduzione ed attivatore trascrizionale (STAT)-3, il principale mediatore della via di trasduzione del segnale di ObR nel cervello, non è stato chiarito. I nostri dati dimostrano che la somministrazione sistemica acuta di leptina è neuroprotettiva in ratti sottoposti ad occlusione permanente dell’arteria cerebrale media (MCAo), come documentato dalla riduzione significativa del volume di infarto cerebrale e del deficit neurologico fino a 7 giorni dopo l’induzione di ischemia. Mediante analisi di immunofluorescenza e tecniche di frazionamento subcellulare abbiamo osservato che la neuroprotezione da leptina è associata con la modulazione dei livelli di fosforilazione di STAT-3 in differenti tipi cellulari nella corteccia cerebrale ischemica. Infatti, poche ore dopo l’insulto la leptina aumenta i livelli di p-STAT3 nel nucleo degli astrociti della penombra ischemica contribuendo così agli effetti benefici di queste cellule sull’evoluzione del danno. L’aumentata espressione di homer-1a che osserviamo negli astrociti fino a 7 giorni dopo l’induzione di ischemia, sottolinea ulteriormente il loro ruolo benefico. Mediante ricostruzione 3D di immagini di microscopia elettronica, combinata con analisi morfometrica, abbiamo osservato che gli astrociti reattivi mostrano un ridotto coverage bilaterale, mentre la percentuale di contatto con le sinapsi glutammatergiche rimane invariata. Inoltre, l’aumento di p-STAT3 indotto dalla leptina nei neuroni dopo 24h di MCAo è associato con un aumento dell’espressione dell’inibitore tissutale delle metalloproteasi della matrice (TIMP)-1 nella corteccia, suggerendo un suo coinvolgimento nella neuroprotezione indotta dall’adipochina
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    Materiali polimerici funzionali per applicazioni farmaceutiche e biomedicali
    (2011-10-26) Ferrarelli, Teresa; Bartolino, Roberto; Trombino, Sonia; Gabriele, Bartolo
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    Profilo tossicologico dell’Olio Essenziale di Bergamotto (Citrus Bergamia, Risso) in vitro e caratterizzazione dei meccanismi coinvolti
    (2011-11-28) Ciociaro, Antonella; Corasaniti, Maria Tiziana; Bagetta, Giacinto
    L’utilizzo di prodotti contenenti estratti vegetali, compresi gli oli essenziali, è ampiamente diffuso nell’industria cosmetica, alimentare e farmaceutica; tuttavia, i meccanismi alla base dei loro effetti risultano spesso non caratterizzati. Nel presente lavoro di tesi sono stati indagati gli effetti dell’olio essenziale di bergamotto (Citrus bergamia, Risso) in colture di neuroblastoma umano, SH-SY5Y, di leucemia mieloide cronica, K-562, ed in cellule con fenotipo normale, in particolare, colture di fibroblasti di cute umana, Hs 605.Sk. Lo studio è stato rivolto alla caratterizzazione della citotossicità indotta dal BEO e all’identificazione dei meccanismi implicati. I risultati ottenuti dimostrano che l’olio essenziale di bergamotto (BEO) riduce la vitalità cellulare in colture SH-SY5Y e K-562 quando impiegato a concentrazioni superiori allo 0,01%. Tale effetto risulta concentrazione- e tempo-dipendente. In tali linee cellulari, a seguito del trattamento con il BEO, alcune cellule presentano un fenotipo necrotico, altre le caratteristiche dell’apoptosi. La morte cellulare non si associa ad aumentata produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS); compatibilmente con un meccanismo di morte ROS-indipendente, l’antiossidante N-acetil-cisteina non previene gli effetti sulla vitalità cellulare indotti dal BEO. In tali condizioni sperimentali, la morte cellulare è preceduta da un rapido collasso del potenziale di membrana mitocondriale ( Ψm). Nelle cellule SH-SY5Y, oltre ad un’alterazione della morfologia mitocondriale, il BEO induce una riorganizzazione delle proteine del citoscheletro, perdita dell’integrità di membrana e riduzione del volume cellulare. Il danno cellula re interessa anche il nucleo ed una percentuale significativa di cellule presenta ipodiploidia. L’esposizione delle cellule SH-SY5Y a concentrazioni citotossiche di BEO induce attivazione della caspasi 3 e clivaggio di PARP; in particolare, il pattern di quest’ultimo, non è compatibile con la sola attivazione della caspasi 3, suggerendo l’attivazione di altre famiglie di proteasi. Tuttavia, l’inibizione farmacologica delle calpaine e delle catepsine mediante pretrattamento con MDL 28170 ed E-64d, rispettivamente, non previene la morte delle cellule SH-SY5Y indotta dal BEO, mentre una parziale protezione è conferita dall’inibitore delle caspasi, Z-VAD-fmk, che riduce in maniera significativa la percentuale di cellule apoptotiche lasciando inalterata la percentuale di cellule che vanno incontro a morte per necrosi. Concentrazioni citotossiche di BEO interferiscono anche con i meccanismi di sopravvivenza cellulare come suggerito dalla riduzione della fosforilazione della chinasi Akt. Inoltre, l’aumento dell’attività proteolitica indotta dal BEO determina degradazione di Akt e riduzione dei sui livelli intracellulari. L’esposizione al BEO di colture di fibroblasti di cute umana, Hs 605.Sk, documenta un profilo tossicologico differente rispetto a quello osservato in colture SH-SY5Y e K-562. La morte cellulare, valutata dopo 24 ore di esposizione al fitocomplesso, presenta prevalentemente le caratteristiche della necrosi; inoltre, essa si osserva solo con concentrazioni superiori allo 0,02%, indicando una minore sensibilità dei fibroblasti agli effetti citotossici del BEO rispetto alle cellule tumorali. Nel complesso, i risultati ottenuti dimostrano che il BEO riduce la vitalità di cellule in proliferazione attivando diverse vie di morte. La comprensione dei meccanismi attraverso i quali i diversi costituenti del BEO interagiscono per indurre necrosi ed apoptosi potrebbe essere utilmente sfruttata in chemioterapia antitumorale dove spesso l’inefficacia dei trattamenti farmacologici è riconducibile ai difetti dell’apoptosi presenti nelle cellulari tumorali. Inoltre, considerando il diffuso impiego del BEO in aromaterapia e la carenza di studi tossicologici, i risultati ottenuti nel presente studio suggeriscono che i prodotti a base di tale olio essenziale debbano essere utilizzati con cautela e, comunque, a diluizioni appropriate, soprattutto quando impiegati mediante applicazione diretta sulla cute e per periodi prolungati
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    Nuove strategie sperimentali per la comprensione e il trattamento dell’ischemia cerebrale
    (2011-11-28) Blasi, Francesco; Bagetta, Giacinto; Moskowitz, Michael A.; Chiarugi, Alberto
    Ischemic stroke is a leading cause of death and long-term disabilities worldwide. Although the pathophysiology of stroke has been studied extensively and several drugs have been proposed in preclinical trials, the pharmacological approach to stroke treatment still remains limited to thrombolysis. The development of neuroprotective strategies is crucial to preserve the integrity of the so-called neurovascular unit (the network of neurons, glial components and endothelial cells which interact regulating brain homeostasis) during and following an ischemic event, and then to increase the chances of neurological recovery. Furthermore, a relevant part of all stroke subtypes has not been studied yet, because the lack of specific animal models able to mimic their pathological features. This Ph.D. Thesis, indeed, was aimed both at study new therapeutic strategies to treat stroke pathology and at elucidate pathophysiological mechanisms not yet fully understood. In the first part of this dissertation, I propose a new drug to treat acute ischemic stroke, the 5’-adenosine monophosphate (AMP). AMP administration reduces the infarct size after 90’ of middle cerebral artery occlusion acting on the modulation of body temperature. In particular, AMP reduces the temperature in a dose-dependent manner through the stimulation of Adenosine-1 receptors in the Central Nervous System, as demonstrated using specific inhibitors. Since endogenous AMP is also able to modulate body temperature, I conclude that the stimulation of AMP signaling pathway is beneficial in an experimental model of stroke and may offer a new target to design neuroprotective drugs In the second part of my Ph.D. Thesis I show the relationship between PARP-1 inhibitors and the mechanisms of ischemic tolerance. PARP-1 inhibition have been shown to improve stroke outcome in several animal models of cerebral ischemia, but its unclear if their use affects the development of brain tolerance. To investigate this aspect, I have studied PARP-1 activity in an animal model of ischemic preconditioning and I have evaluated the extent of neuroprotection provided by the brain conditioning using both pharmacological and genetic modulation of PARP-1. My results show that PARP-1 is not involved in our model of ischemic preconditioning and its pharmacological modulation doesn’t affect the mechanisms of brain tolerance The last chapter is focused on a new animal model to study the lacunar stroke. Deep white matter and lacunar strokes accounts for more than one quarter of all ischemic strokes, but our knowledges of this stroke subtype are incomplete. I have characterized a selective model of sub-cortical white matter stroke, showing both axonal and myelin degeneration and behavioral deficits induced by a lesion strategically located to mimic human pathology. Since the development of vascular dementia, a neurological condition leading to progressive cognitive skills loss and strictly connected to lacunar strokes, is associated with blood brain barrier (BBB) disruption, I have studied the time-course of BBB opening in this animal model to clarify the relationship between white matter fiber degeneration and BBB breakdown leading to vasogenic edema. This model can help to better understand important pathophysiological mechanisms in the field of ischemic lacunar strokes
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