Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione - Tesi di Dottorato

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Questa collezione raccoglie le Tesi di Dottorato afferenti al Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione dell'Università della Calabria.

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Author: search.filters.author.Bagetta, GiacintoSubject: search.filters.subject.Farmacologia

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    Profilo tossicologico dell’Olio Essenziale di Bergamotto (Citrus Bergamia, Risso) in vitro e caratterizzazione dei meccanismi coinvolti
    (2011-11-28) Ciociaro, Antonella; Corasaniti, Maria Tiziana; Bagetta, Giacinto
    L’utilizzo di prodotti contenenti estratti vegetali, compresi gli oli essenziali, è ampiamente diffuso nell’industria cosmetica, alimentare e farmaceutica; tuttavia, i meccanismi alla base dei loro effetti risultano spesso non caratterizzati. Nel presente lavoro di tesi sono stati indagati gli effetti dell’olio essenziale di bergamotto (Citrus bergamia, Risso) in colture di neuroblastoma umano, SH-SY5Y, di leucemia mieloide cronica, K-562, ed in cellule con fenotipo normale, in particolare, colture di fibroblasti di cute umana, Hs 605.Sk. Lo studio è stato rivolto alla caratterizzazione della citotossicità indotta dal BEO e all’identificazione dei meccanismi implicati. I risultati ottenuti dimostrano che l’olio essenziale di bergamotto (BEO) riduce la vitalità cellulare in colture SH-SY5Y e K-562 quando impiegato a concentrazioni superiori allo 0,01%. Tale effetto risulta concentrazione- e tempo-dipendente. In tali linee cellulari, a seguito del trattamento con il BEO, alcune cellule presentano un fenotipo necrotico, altre le caratteristiche dell’apoptosi. La morte cellulare non si associa ad aumentata produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS); compatibilmente con un meccanismo di morte ROS-indipendente, l’antiossidante N-acetil-cisteina non previene gli effetti sulla vitalità cellulare indotti dal BEO. In tali condizioni sperimentali, la morte cellulare è preceduta da un rapido collasso del potenziale di membrana mitocondriale ( Ψm). Nelle cellule SH-SY5Y, oltre ad un’alterazione della morfologia mitocondriale, il BEO induce una riorganizzazione delle proteine del citoscheletro, perdita dell’integrità di membrana e riduzione del volume cellulare. Il danno cellula re interessa anche il nucleo ed una percentuale significativa di cellule presenta ipodiploidia. L’esposizione delle cellule SH-SY5Y a concentrazioni citotossiche di BEO induce attivazione della caspasi 3 e clivaggio di PARP; in particolare, il pattern di quest’ultimo, non è compatibile con la sola attivazione della caspasi 3, suggerendo l’attivazione di altre famiglie di proteasi. Tuttavia, l’inibizione farmacologica delle calpaine e delle catepsine mediante pretrattamento con MDL 28170 ed E-64d, rispettivamente, non previene la morte delle cellule SH-SY5Y indotta dal BEO, mentre una parziale protezione è conferita dall’inibitore delle caspasi, Z-VAD-fmk, che riduce in maniera significativa la percentuale di cellule apoptotiche lasciando inalterata la percentuale di cellule che vanno incontro a morte per necrosi. Concentrazioni citotossiche di BEO interferiscono anche con i meccanismi di sopravvivenza cellulare come suggerito dalla riduzione della fosforilazione della chinasi Akt. Inoltre, l’aumento dell’attività proteolitica indotta dal BEO determina degradazione di Akt e riduzione dei sui livelli intracellulari. L’esposizione al BEO di colture di fibroblasti di cute umana, Hs 605.Sk, documenta un profilo tossicologico differente rispetto a quello osservato in colture SH-SY5Y e K-562. La morte cellulare, valutata dopo 24 ore di esposizione al fitocomplesso, presenta prevalentemente le caratteristiche della necrosi; inoltre, essa si osserva solo con concentrazioni superiori allo 0,02%, indicando una minore sensibilità dei fibroblasti agli effetti citotossici del BEO rispetto alle cellule tumorali. Nel complesso, i risultati ottenuti dimostrano che il BEO riduce la vitalità di cellule in proliferazione attivando diverse vie di morte. La comprensione dei meccanismi attraverso i quali i diversi costituenti del BEO interagiscono per indurre necrosi ed apoptosi potrebbe essere utilmente sfruttata in chemioterapia antitumorale dove spesso l’inefficacia dei trattamenti farmacologici è riconducibile ai difetti dell’apoptosi presenti nelle cellulari tumorali. Inoltre, considerando il diffuso impiego del BEO in aromaterapia e la carenza di studi tossicologici, i risultati ottenuti nel presente studio suggeriscono che i prodotti a base di tale olio essenziale debbano essere utilizzati con cautela e, comunque, a diluizioni appropriate, soprattutto quando impiegati mediante applicazione diretta sulla cute e per periodi prolungati
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    Caratterizzazione del ruolo svolto dal Nerve Growth Factor e dai suoi recettori nel differenziamento cellulare dei podociti umani
    (2013-11-28) Carito, Valentina; Bagetta, Giacinto; Caroleo, Maria Cristina
    Il Nerve Growth Factor (NGF) è una proteina solubile appartenente alla famiglia delle neurotrofine. Inizialmente scoperto e studiato per il suo ruolo chiave nello stimolare la crescita e il differenziamento neuronale, il NGF è oggi considerato un mediatore in grado di modulare l’attività biologica di svariate popolazioni cellulari non-neuronali. Le azioni biologiche del NGF sono mediate dal legame, sulle cellule target, a specifici recettori di membrana: il recettore ad alta affinità, TrkA, dotato di attività tirosinchinasica intrinseca e responsabile del controllo della sopravvivenza, del differenziamento e della proliferazione cellulare, e il recettore a bassa affinità, p75NTR, appartenente alla famiglia dei recettori di morte, in grado di indurre apoptosi o sopravvivenza cellulare. Diverse osservazioni sperimentali hanno documentato che il NGF e i suoi recettori sono presenti nel rene sano ed affetto da varie patologie, tuttavia è ancora poco nota l’esatta funzione che la neurotrofina riveste nel controllo dell’attività funzionale delle varie popolazioni cellulari renali. Nell'ambito della fisiopatologia renale un ruolo centrale è senz'altro svolto dai podociti, cellule dinamiche altamente specializzate, dotate di una sofisticata architettura cellulare e sub-cellulare, caratterizzate da un voluminoso corpo cellulare, lunghi processi primari e numerosi pedicelli. La funzione principale dei podociti è quella di garantire, insieme alle cellule endoteliali dei capillari glomerulari ed alla membrana glomerulare basale, la selettiva permeabilità di filtrazione della barriera glomerulare. L’integrità di tale struttura anatomica è sostenuta, oltre che dalla presenza di popolazioni cellulari specializzate anche dall’azione trofica esercitata da diversi fattori solubili di natura proteica, che agiscono sia in maniera autocrina che paracrina, tra i quali citochine e fattori di crescita. Poiché i podociti e le cellule nervose condividono diverse caratteristiche biologiche, l’espressione di molecole criticamente importanti per la loro funzione e il mantenimento della loro complessa struttura, nonché la stessa origine ontogenetica, il NGF potrebbe giocare un ruolo fondamentale nella maturazione, nei cambiamenti strutturali e quindi nella funzione delle cellule podocitarie, analogamente a quanto già descritto a livello neuronale. I risultati del presente studio hanno evidenziato, per la prima volta, come i podociti umani immaturi, in corso di differenziamento e completamente differenziati, esprimono costitutivamente il messaggero per il NGF e per i suoi recettori, TrkA e p75NTR. Tale espressione genica è associata, in tutte le condizioni sperimentali, alla produzione, in forma matura, delle proteine recettoriali TrkA e p75NTR ed alla sintesi della neurotrofina in forma biologicamente attiva. L’analisi della distribuzione recettoriale a livello cellulare, condotta mediante microscopia elettronica, ha permesso di evidenziare che l’espressione sub-cellulare di entrambi i recettori varia in funzione dello stadio di maturazione podocitaria, con evidenti differenze nella localizzazione dei recettori ad alta e a bassa affinità, tra podociti proliferanti e podociti maturi. Di notevole interesse è l'evidenza, esclusivamente nella popolazione podocitaria indifferenziata, di una localizzazione di entrambi i recettori per la neurotrofina nel compartimento mitocondriale. L’analisi, mediante studi di immunoprecipitazione, dell'associazione tra i recettori TrkA e p75 e specifiche proteine mitocondriali, quali il traslocatore per il nucleotide adenina (ANT) e la fosfodiesterasi 4 isoforma A5 (PDE4A5), nonché l'evidenza di più elevati livelli di fosfo-ERK1/2 a livello del compartimento mitocondriale dei podociti immaturi rispetto a quelli proliferanti, ha consentito di ipotizzare, per la prima volta, un possibile ruolo del NGF e dei suoi recettori nel controllo dell'omeostasi energetica e nell'induzione di specifici pathways mitocondriali coinvolti nel mantenimento dello stato proliferativo. Gli studi volti a definire il ruolo funzionale del sistema NGF/recettori per il NGF nell’ambito della popolazione cellulare podocitaria hanno inoltre documentato come la deprivazione di NGF (mediante anticorpi anti-NGF), nei podociti immaturi, non ha alcun effetto sul ciclo cellulare, sull'espressione dei recettori per la neurotrofina e sulla loro distribuzione a livello subcellulare, mentre nei podociti in corso di differenziamento, l'esposizione agli anticorpi anti-NGF induce drammatiche alterazioni della morfologia cellulare, con perdita della corretta estensione dei pedicelli e notevole alterazione nell'organizzazione del citoscheletro. Si è anche osservata una riduzione selettiva dei livelli proteici di sinaptopodina, non associata a concomitante diminuzione dei livelli di mRNA, indicando un probabile effetto post-traduzionale della neurotrofina, probabilmente dovuto ad una riduzione dell’attività di fosforilazione della PKA che renderebbe così la sinaptopodina maggiormente esposta al clivaggio da parte della Lcatepsina. E’ noto che il recettore a bassa affinità per il NGF, p75NTR, è coinvolto nel controllo del pathway cAMP/PKA mediante interazione con la PDE4A. Studi di coimmunoprecipitazione del recettore per il NGF p75NTR con la PDE4A su lisati totali di podociti differenziati, di controllo o esposti al trattamento con anticorpi anti-NGF, hanno dimostrato che, nei podociti in corso di maturazione, la deprivazione di NGF induce un aumento dell’interazione p75-PDE4A5, cui consegue una riduzione dei livelli di cAMP e dell’attività della PKA; questo determina infine una maggiore esposizione della sinaptopodina all’attacco da parte della L-catepsina. In conclusione, i risultati ottenuti in questo lavoro di tesi evidenziano che il NGF ha un ruolo chiave nella fisiopatologia del podocita e, considerando l’enorme importanza che la neurotrofina sembra avere nell’ambito del corretto differenziamento podocitario e nel mantenimento della corretta morfologia cellulare, si intravedono possibili prospettive applicative del NGF quale valido strumento terapeutico nel trattamento di patologie renali croniche associate a proteinuria, dal momento che la compromissione della funzione podocitaria ne rappresenta l’evento patogenetico precoce e determinante
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    Nuove strategie sperimentali per la comprensione e il trattamento dell’ischemia cerebrale
    (2011-11-28) Blasi, Francesco; Bagetta, Giacinto; Moskowitz, Michael A.; Chiarugi, Alberto
    Ischemic stroke is a leading cause of death and long-term disabilities worldwide. Although the pathophysiology of stroke has been studied extensively and several drugs have been proposed in preclinical trials, the pharmacological approach to stroke treatment still remains limited to thrombolysis. The development of neuroprotective strategies is crucial to preserve the integrity of the so-called neurovascular unit (the network of neurons, glial components and endothelial cells which interact regulating brain homeostasis) during and following an ischemic event, and then to increase the chances of neurological recovery. Furthermore, a relevant part of all stroke subtypes has not been studied yet, because the lack of specific animal models able to mimic their pathological features. This Ph.D. Thesis, indeed, was aimed both at study new therapeutic strategies to treat stroke pathology and at elucidate pathophysiological mechanisms not yet fully understood. In the first part of this dissertation, I propose a new drug to treat acute ischemic stroke, the 5’-adenosine monophosphate (AMP). AMP administration reduces the infarct size after 90’ of middle cerebral artery occlusion acting on the modulation of body temperature. In particular, AMP reduces the temperature in a dose-dependent manner through the stimulation of Adenosine-1 receptors in the Central Nervous System, as demonstrated using specific inhibitors. Since endogenous AMP is also able to modulate body temperature, I conclude that the stimulation of AMP signaling pathway is beneficial in an experimental model of stroke and may offer a new target to design neuroprotective drugs In the second part of my Ph.D. Thesis I show the relationship between PARP-1 inhibitors and the mechanisms of ischemic tolerance. PARP-1 inhibition have been shown to improve stroke outcome in several animal models of cerebral ischemia, but its unclear if their use affects the development of brain tolerance. To investigate this aspect, I have studied PARP-1 activity in an animal model of ischemic preconditioning and I have evaluated the extent of neuroprotection provided by the brain conditioning using both pharmacological and genetic modulation of PARP-1. My results show that PARP-1 is not involved in our model of ischemic preconditioning and its pharmacological modulation doesn’t affect the mechanisms of brain tolerance The last chapter is focused on a new animal model to study the lacunar stroke. Deep white matter and lacunar strokes accounts for more than one quarter of all ischemic strokes, but our knowledges of this stroke subtype are incomplete. I have characterized a selective model of sub-cortical white matter stroke, showing both axonal and myelin degeneration and behavioral deficits induced by a lesion strategically located to mimic human pathology. Since the development of vascular dementia, a neurological condition leading to progressive cognitive skills loss and strictly connected to lacunar strokes, is associated with blood brain barrier (BBB) disruption, I have studied the time-course of BBB opening in this animal model to clarify the relationship between white matter fiber degeneration and BBB breakdown leading to vasogenic edema. This model can help to better understand important pathophysiological mechanisms in the field of ischemic lacunar strokes
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    Ruolo di iASPP nella regolazione del Mismatch repair in melanoma
    (2014-05-22) Senatore, Valentina; Genchi, Giuseppe; Bagetta, Giacinto
    Cutaneous melanoma is an aggressive malignancy accounting for 4% of skin cancers but 80% of all skin-cancer related deaths. Its incidence is rapidly rising and advanced disease is notoriously treatment-resistant. The role of apoptosis in melanoma pathogenesis and chemoresistance is poorly characterized. Mutations in p53 occur infrequently and are not critical for tumour development. This may alternatively result from p53 upstream or downstream pathway defects or from alterations of p53 family co-activators, including the ASPP family members (Apoptosis Stimulating Proteins of p53). iASPP is the inhibitory member of the ASPP family. By binding p53, iASPP is believed to inhibit apoptosis in cancer, resulting in its oncogenic role. Recently it has been found highly expressed in several types of cancer, such as endometrial and hepatocellular carcinoma, acute leukemia and breast cancer. iASPP upregulation in some cases occurs with a concomitant downregulation of ASPP expression, the pro-apoptotic family member, thus providing a further option for targeting the p53 family in the treatment of cancers. So far, iASPP expression and its role in skin cancer is not yet been explored. Recently great attention has been given to DNA repair processes in melanoma, particularly to Mismatch Repair (MMR). This is a DNA damage repair mechanism, correcting bases mismatches due to replication errors or exogenous agents’ activity, whose defects have been demonstrated leading to genomic instability (microsatellite instability, MSI) frequently linked with cancer. MSI and altered expression of MMR factors such as MSH2 and MLH1 (both at mRNA and protein levels) has often been observed in primary and metastatic melanoma, compared to normal melanocytes and nevi. 8 Aim of this study is to investigate the role of iASPP in melanoma and particularly its involvement in DNA repair and apoptosis. In this work we used RT-PCR and western blot techniques to demonstrate that both MMR factors and iASPP were expressed at higher levels in several melanoma cell lines, mainly metastatic, compared to primary melanocytes extracted from human skin. We also observed a post-translational modification in the MSH2 protein (which is due at least to an ubiquitination) upon increased iASPP expression in three different melanoma cell lines, independently of p53 status. This results in an increase of DNA repair activity measured by MutS(MSH2/MSH6 complex) binding to a DNA bases mismatch. To confirm these results, we used a set of shRNAs targeting iASPP gene in metastatic melanoma cell line WM1158 and we found that the reduction of iASPP leads to a lower MSH2 protein expression, without affecting MLH1, and to a 50% reduction of MutS activity. Immunoprecipitation experiments showed that iASPP directly binds endogenous MSH2 and MLH1 in melanoma cells and this interaction was confirmed by immunostaining where iASPP partially co-localized with MMR factors in the nucleus of melanoma cells. Moreover, iASPP silencing and its consequent reduction in expression and activity of MMR factors, is able to sensitize melanoma cells to apoptosis induced by chemotherapeutic agent cisplatin. Taken together these results confirm the antiapoptotic role of iASPP and suggest a novel role of iASPP in melanoma, such as a modulator of MMR that may help in the future to explain further its oncogenic role in cancer. This study is also the first report available about iASPP expression in melanoma, highlighting the importance of investigating further this important target gene in such a chemoresistant disease. Future studies will be necessary to further elucidate the mechanism by which iASPP interferes with the MMR system and how it affects apoptosis and cell cycle progression in melanoma disease.