Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione - Tesi di Dottorato
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Questa collezione raccoglie le Tesi di Dottorato afferenti al Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione dell'Università della Calabria.
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Item GPER mediates the up-regulation of acid synthase (fasn) intuced by 17B-estradiol in cancer cell and in cancer-associated fibroblasts (CAFs)(2012-11-26) Santolla, Maria Francesca; Maggiolini, Marcello; Sisci, DiegoActivation of lipid metabolism is an early event in carcinogenesis and a central hallmark of many tumors. Fatty acid synthase (FASN) is a key lipogenic enzyme catalyzing the terminal steps in the de novo biogenesis of fatty acids. In cancer cells, FASN may act as a metabolic oncogene given that it confers growth and survival advantages to these cells, whereas its inhibition effectively and selectively kills tumor cells. Hormones like estrogens and growth factors contribute to the transcriptional regulation of FASN expression also through the activation of downstream signaling and a crosstalk among diverse transduction pathways. In this study, we demonstrate for the first time that 17β-estradiol (E2) and the selective GPER ligand G-1 regulate FASN expression and activity through the GPER-mediated signaling which involved the EGFR/ERK/c-fos/AP1 transduction pathway, as ascertained by using specific pharmacological inhibitors, performing gene-silencing experiments and ChiP assays in breast SkBr3, colorectal LoVo, hepatocarcinoma HepG2 cancer cells and breast cancerassociated fibroblasts (CAFs). In addition, the proliferative effects induced by E2 and G-1 in these cells involved FASN as the inhibitor of its activity, named cerulenin, abolished the growth response to both ligands. Our data suggest that GPER may be included among the transduction mediators involved by estrogens in regulating FASN expression and activity in cancer cells and CAFs that strongly contribute to cancer progression.Item FoxO3a reactivation restores the sensitivity to the antiestrogen treatment in tamoxifen resistant breast cancer(2017-06-12) Donà, Ada Alice; Andò, Sebastiano; Sisci, DiegoResistance to endocrine treatments is a major clinical challenge in the management of estrogen receptor alpha positive (ER+) breast cancers (BC). Although multiple mechanisms leading to endocrine resistance have been proposed, the poor outcome of this subgroup of BC patients demands additional studies. Here we show that the expression of FoxO3a transcription factor is strongly reduced in ER+ BC MCF-7 cells (wtMCF-7) that developed resistance to Tamoxifen (TamR). On the other hand, FoxO3a silencing (siF3a) was able to counteract Tam induced growth inhibition in wtMCF-7, demonstrating that FoxO3a is a mediator of cell response to Tam. To analyze the role of FoxO3a in the acquisition of a Tam resistant phenotype, TamR clones bearing an active FoxO3a (F3aAAA), whose expression can be induced by Doxycycline (Dox) were developed. FoxO3a re-activation was able to re-establish the sensitivity of TamR cells to the antiestrogen, inhibiting proliferation and cell cycle progression, as well as restoring Tam dependent apoptotic response. For a closer look at the molecular mechanisms involved, an unbiased proteomics analysis on F3aAAA-inducible TamR cells was conducted, unveiling novel interesting and potential mediators of the anti-proliferative and pro-apoptotic activity of FoxO3a, all worthy of future investigations. Kaplan-Meier (K-M) survival curves confirmed the relevance of FoxO3a also in a clinical setting, since high levels of the transcription factor strongly correlate to a positive response to tamoxifen therapy. Finally, to assess if FoxO3a reactivation is able to restore the sensitivity to Tam also in vivo, the widely used anti-epileptic drug (AED) Lamotrigine (LTG; Lamictal), which is able to induce FoxO3a expression in TamR cells leading to growth inhibition, was also tested on TamR deriving xenografts tumors, where it showed the same effects observed in vitro. Altogether, our data indicate that FoxO3a could not only be considered a good prognostic factor in ER+ BC, predicting a positive response to endocrine therapy, but also a key target to be exploited in combination therapy. In this context, LTG might represent a valid candidate to be used as an adjuvant to Tam therapy in patients at risk.Item Identificazione del recettore strogenico GPER (G-protein-couple estrogen receptor) nella ghiandola prostatica umana: valutazione del GPER nei tessuti prostateci benigni e neoplastici(2015-12-18) Rago, Vittoria; Sisci, Diego; Carpino, AmaliaGli estrogeni sono coinvolti nella crescita, differenziazione e patogenesi della prostata umana attraverso la mediazione dei classici recettori estrogenici (ER e ER). D'altro canto, il meccanismo non genomico degli estrogeni sembra esercitare un ruolo importante su segnalazioni di percorsi che dirigono o indirettamente modulano l'espressione genica. In questo scenario, il G protein-coupled receptor, GPER (precedentemente chiamato GPR30), è stato implicato nella mediazione rapida degli eventi trascrizionali in risposta agli estrogeni. Alcuni studi supportano l'ipotesi che GPER rappresenta un recettore estrogeno-sensibile e la sua iper-espressione sembra essere fondamentale i diverse patologie neoplasiche. L’espressione di GPER è stata recentemente evidenziata in alcuni tessuti riproduttivi umani, ma la sua espressione a livello prostatico è ancora sconosciuta. In questo studio, abbiamo valutato, l’espressione di GPER in 5 pazienti affetti da patologie prostatiche non neoplastiche, e in 50 pazienti affetti da adenocarcinoma, mediante analisi immunoistochimica e Western blot.. Le aree normali della prostata benigna hanno mostrato una forte immunoreattività del GPER nel citoplasma delle cellule epiteliali basali insieme ad una debole colorazione nel citoplasma delle cellule stromali. Nessuna immunocolorazione è stata invece osservata nelle cellule epiteliali luminali secretorie. L’analisi immunoistochimica ha evidenziato l’espressione cellulare di GPER in tutti i campioni di adenocarcinoma esaminati ma con una variabilità correlata alle diverse architetture delle cellule tumorali (Gleason patterns). Le regioni che presentavano lesioni pre-neoplastiche HGPIN (high-grade prostatic intraepithelial neoplasia) hanno evidenziato una intensa immunoreattività per il recettore, mentre nelle aree tumorali la positività al GPER è stata correlata ai “Gleason patterns” e valutata con il metodo di Allred. Una intensa immunoposititvità al GPER è stata evidenziata nelle aree tumorali Gleason pattern 2 e pattern Gleason 3 (leggermente ridotta in queste ultime), mentre debolmente colorate apparivano le aree con Gleason pattern 4. L’analisi Western blot degli estratti proteici benigni e tumorali ha confermato questo risultato. È stato inoltre osservato un aumento delle forme fosforilate dei livelli di Akt e di CREB nei campioni di pazienti affetti da adenocarcinoma scarsamente differenziato rispetto alle altre categorie. In conclusione, nel presente lavoro, per la prima volta, abbiamo identificato GPER nelle cellule basali epiteliali della prostata umana non neoplastica, con una diversa localizzazione rispetto ai classici recettori estrogenici. Abbiamo inoltre evidenziato l'espressione di GPER nelle cellule di adenocarcinoma prostatico ma con una modulazione della sua intensità dipendente dall’organizzazione delle cellule neoplastiche. La immunoreattività al GPER appare quindi inversamente correlata al grado di differenziazione tumoralItem New natural statin-like compounds with anticholesterolemic and antiproliferative properties: "in vitro and in vivo studies"(2015-12-18) Fiorillo, Marco; Sisci, Diego; Cappello, AnnaritaIl rischio di malattia coronaria è aumentato negli individui che mostrano elevata concentrazione di colesterolo nelle lipoproteine plasmatiche a bassa densità (LDL). E’ stato dimostrato che l’inibizione del 3-idrossi-3-metilglutaril-CoA reduttasi (HMGR), enzima che catalizza la conversione di HMG-CoA in mevalonato (MVA), tappa limitante la velocità di biosintesi del colesterolo, è l’approccio più efficace per la diminuzione plasmatica di LDL e la riduzione del tasso di eventi cardiovascolari. Come parte di un meccanismo compensatorio, alla deplezione di colesterolo nel fegato, dovuto all’inibizione dell’enzima HMGR, segue l’aumento della produzione di recettori per le LDL e il successivo smaltimento di LDL dalla circolazione sistemica. Gli inibitori di HMGR rappresentano la classe di farmaci più efficaci e maneggevoli per la riduzione della concentrazione di LDL. Sebbene le statine siano gli inibitori di HMGR più largamente prescritti, sono associate a spiacevoli effetti collaterali quali severa miopatia e perdita della memoria statinoassociata. In questo contesto l’identificazione di nuovi composti statino-simili, che agiscono come inibitori di HMGR, risulta utile per superare le limitazioni già descritte. E’ stato dimostrato che alcuni composti naturali, che si ritrovano nella nostra dieta, hanno proprietà terapeutiche e farmacologiche. In particolare studi condotti in seguito a somministrazione cronica di succo di alcune specie di Citrus hanno confermato che questa strategia influenza positivamente i livelli plasmatici dei lipidi e può essere associata alla riduzione del rischio di malattia coronarica. Durante questo lavoro di tesi , l’attenzione è stata rivolta allo studio di due flavonoidi, statino-simili, (brutieridina e melitidina) estratte dal bergamotto (Citrus bergamia), ma presenti anche in altre specie del genere Citrus. Come molecola di riferimento è stata considerata la statina commerciale più prescritta nell’uomo, la simvastatina. Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando una frazione arricchita delle due molecole (EF) ed una purificata (BMF), al 99%. I composti testati, sono stati isolati e caratterizzati in maniera esaustiva, mediante spettrometria di massa e risonanza magnetica, dal gruppo di ricerca del Prof. G. Sindona (Dip.to di Chimica, Università della Calabria). In particolare, si è valutata “in vivo”, l’attività ipocolesterolemica e ipolipidemica delle frazioni oggetto di studio. In primo luogo è stato ottenuto un modello animale ipercolesterolemico, in seguito al trattamento degli animali (ratti) con una dieta opportuna. Successivamente, sul modello ottenuto è stato monitorato il metabolismo del colesterolo, mediante la valutazione del livello di espressione dei geni codificanti l’enzima HMGR ed il recettore delle LDL, sia a livello di trascritto che a livello proteico. Il metabolismo dei trigliceridi, invece, è stato monitorato valutando il livello di trascritto e di proteina del gene che codifica per il principale enzima della sintesi degli acidi grassi e quindi dei trigliceridi, il gene FASN. Inoltre sono stati valutati i livelli di colesterolo e di trigliceridi nel fegato e nel sangue ed è stata determinata sia l’attività di HMGR che quella di due enzimi coinvolti nella lipogenesi, in quanto responsabili della produzione di NADPH, utilizzato per la sintesi degli acidi grassi e del colesterolo, enzima malico e isocitrato deidrogenasi. I risultati ottenuti hanno evidenziato, nei ratti trattati con BMF, una riduzione dei livelli di colesterolo e dei trigliceridi, sia a livello epatico che sierico, tale decremento è risultato essere ancora più evidente nei ratti trattati con EF, rispetto ai controlli ipercolesterolemici. Dalla valutazione dei livelli di trascrizione di due principali proteine coinvolte nel metabolismo del colesterolo, HMGR ed LDLR e dell'enzima principale della biosintesi degli acidi grassi, FASN, è emerso chiaramente che il comportamento di BMF è simile a quello della simvastatina, uno dei farmaci ipocolesterolemici più utilizzati. Infine, dalla valutazione dell’attività degli enzimi HMGR, isocitrato deidrogenasi citoplasmatica ed enzima malico, negli epatociti degli animali trattati con le due frazioni rispetto a quella evidenziata negli epatociti dei ratti controllo, è stata riscontrata un’inibizione, anche in questo caso, paragonabile a quella osservata per i ratti trattati con simvastatina. Attraverso lo studio condotto è stato dimostrato che le due molecole estratte dal bergamotto, brutieridina e melitidina, sono dotate di attività ipocolesterolemica, dovuta all’azione inibitoria esercitata nei confronti dell’enzima HMGR. L’interesse scientifico inoltre, è stato quello di valutare “in vitro”, l’aspetto anti-proliferativo ed antinfiammatorio dei due flavonoidi studiati. Infatti, in letteratura è riportato che le statine sintetiche riducono la proliferazione di un’ampia varietà di tipi cellulari, “in vitro”, inducendo l’arresto del ciclo cellulare nella fase G1. Questa sperimentazione è stata condotta su cellule di carcinoma mammario umano, MCF7, utilizzando la frazione purificata (BMF) e comparando i risultati con quelli ottenuti dopo trattamento di cellule della stessa linea con simvastatina (profarmaco precedentemente utilizzato per gli studi “in vivo”) e pravastina. Il lavoro svolto ha previsto, in primo luogo, la creazione di una linea tumorale, stabile, che fosse in grado di over-esprimere il gene HMGCR (MCF-7-HMGCR), utilizzando un metodo di trasfezione virale; successivamente è stata valutata l’attività proliferativa delle cellule tumorali (MCF-7); delle cellule tumorali trasfettate con il gene HMGCR (MCF-7-HMGCR) e di quelle epiteliali non tumorali (fibroblasti hTERT-BJ1), dopo trattamento con BMF, pravastatina e simvastatina. I risultati ottenuti hanno dimostrato che alte concentrazioni di BMF svolgono un’azione antiproliferativa meno elevata di quella riscontrata con concentrazioni più basse di simvastatina. Tuttavia è doveroso sottolineare che mentre BMF e pravastatina non inibiscono la proliferazione cellulare, nelle cellule non tumorali, la simvstatina è risultata essere tossica anche a basse concentrazioni. Mediante analisi con XFe96 Seahorse Analyzersi è effettuata la valutazione metabolica delle linee cellulari MCF-7, MCF-7-HMGCR, hTERT-BJ1. I risultati ottenuti hanno evidenziato un’aumentata respirazione mitocondriale (OCR) nella linea MCF-7-HMGCR rispetto alla MCF-7; nessuna differenza in termini di funzione glicolitica (ECAR) è stata, invece, riscontrata tra le due linee cellulari. Inoltre, la respirazione mitocondriale, in cellule MCF-7-HMGCR, dopo trattamento con BMF, ha evidenziato una riduzione della produzione di ATP e una diminuzione della respirazione massimale e della capacità respiratoria cellulare. Infine, le analisi OCR su cellule hTERT-BJ1 dopo trattamento con BMF, pravastatina e simvastatina hanno sottolineato una riduzione della respirazione mitocondriale minima, nelle cellule trattate con pravastatina; tale riduzione è risultata essere più marcata nelle cellule trattate con simvastatina. Nessuna differenza è stata, invece, riscontrata nelle cellule trattate con BMF. Questi risultati hanno confermato una leggera tossicità nelle cellule hTERT-BJ1 trattate con pravastatina ed una marcata tossicità in quelle trattate con simvastatina, a differenza delle cellule trattate con BMF. Inoltre, l’indagine effettuata su diversi pathways, implicati nella proliferazione cellulare e nell’infiammazione, ha evidenziato un potenziale effetto antinfiammatorio e antiossidante di BMF, come sottolineato da un aumento della risposta antiossidante e di quella immunitaria regolate dall’interferone I, da una diminuzione della risposta infiammatoria mediata dall’interferone-gamma e da una down-regolazione della via infiammatoria regolata dal gene STAT3, in cellule MCF-7, trattate con BMF. Il trattamento con BMF ha determinato, inoltre, la down-regolazione di due pathways coinvolti nella proliferazione tumorale e nella formazione di CSCs (cancer stem cells), regolati da Notch e Wnt. Questi risultati hanno portato ad indagare su un’eventuale coinvolgimento di BMF, nella formazione di mammospheres e a dimostrare, dopo trattamento con BMF, un decremento nella efficienza di formazione di mammospheres, dose dipendente, più marcato nelle cellule che over-esprimono l’enzima HMGCR. Successivamente, è stata riscontrata, per BMF, la capacità di ridurre lo stress ossidativo, la formazione di radicali liberi e la successiva risposta pro-infiammatoria, come evidenziato dalla diminuizione dell’espressione delle citochine pro-infiammatorie, regolata dal complesso proteico NF-kB e dalla diminuizione dell’espressione dei fattori inducibili l’ipossia, regolata dal gene HIF, riscontrate in cellule hTERT-BJ1, trasfettare con i gene reporter Nf-KB e HIF e trattate con BMF. Infine è stato valutato l’effetto antinfiammatorio ed antiossidante della frazione purificata di brutieridina e melitidina; dai risultati ottenuti è stato possibile evincere una riduzione dei fattori di stimolazione, coinvolti nella formazione dei granulociti e dei macrofagi, in cellule MCF-7 trattate con pravastatina ed, in egual misura, in quelle trattate con BMF. Anche la produzione di IL-8, in cellule trattate con BMF, ha mostrato un decremento, di poco inferiore a quello riscontrato in cellule trattate con pravastatina. Infine la riduzione di cancer stem cells (CSC) è stata valutata tramite l’impiego di un marker specifico (ALDH) che ha permesso di isolare la popolazione ALDEFLUOR-positiva relativa alla popolazione staminale, in cellule MCF7. Dopo trattamento con BMF e pravastatina, è emersa una netta diminuzione della popolazione ALDEFLUOR-positiva, nella linea cellulare MCF7. Pertanto, l’aggiunta di colesterolo (prodotto della biosintesi del mevalonato) al mezzo cellulare, in presenza di BMF e/o pravastatina , non ha cambiato la percentuale di riduzione della popolazione di CSCs. Al contrario l’aggiunta di mevalonato al mezzo di coltura, ha riportato sia il numero di mammospheres che la percentuale della popolazione di CSCs ai valori del controllo. Questi risultati hanno permesso di indicare la BMF come un composto con scarsa tossicità e capace di prevenire la crescita tumorale, l’espansione tumorale mediata da fattori pro-infiammatori e la fomazione di CSCs. L’impiego della BMF in concomitanza ai canonici chemioterapici, potrebbe migliorare l’effetto degli stessi e diventare un nuovo target drug nella terapia add-on.Item Expression and function of phosphodiesterase Type 5 in human breast cancer cell lines and ttissues: implications for targeted therapy(2015-12-18) Campana, Antonella; Sisci, Diego; Barone, InesItem Study of new ligands of steroid receptors: the effects of G-1 (a mew ligand of GEPR) and development of a novel cell-based androgen screening model(2015-12-18) Campana, Carmela; Sisci, Diego; Pezzi, VincenzoItem <> role of intrinsic and extrinsic signals in the regulation of brest cancer stem cell activity(2015-12-18) Chemi, Francesca; Sisci, Diego; Catalano, StefaniaIl carcinoma mammario rappresenta la neoplasia a maggiore incidenza nel sesso femminile. Nonostante i numerosi progressi da un punto di vista diagnostico e terapeutico, metastasi e recidiva tumorale rappresentano ancora le principali cause di morte nelle pazienti affette da carcinoma mammario. Recentemente, numerosi studi hanno suggerito la presenza di una sottopopolazione di cellule con caratteristiche di staminalità chiamate cellule staminali tumorali (CSCs), che svolgono un ruolo importante nel sostegno della crescita e della progressione tumorale. Le CSCs, così come le cellule staminali normali, sono caratterizzate dalla capacità di auto-rinnovamento (self-renewal) e di differenziazione. Da un punto di vista clinico, il principale problema inerente le cellule staminali tumorali, riguarda la loro resistenza ai trattamenti convenzionali (terapia endocrina, chemio- e radioterapia), caratteristica che potenzialmente potrebbe essere la causa della recidiva tumorale e delle metastasi. Le cellule staminali del tumore mammario sono regolate sia da segnali intrinseci che da segnali estrinseci derivanti da elementi appartenenti al microambiente tumorale che le circonda, la cosiddetta “nicchia” delle cellule staminali tumorali. Tra i segnali intrinseci, i pathways embrionali, come Notch, Wnt e Hedgehog risultano frequentemente deregolati nel carcinoma mammario. In particolare, il segnale di Notch4 svolge un ruolo di notevole importanza nel contesto della staminalitá in quanto la sua attivitá risulta essere significativamente più elevata in cellule staminali di carcinoma mammario rispetto alle cellule tumorali differenziate e la sua inibizione riduce la crescita delle mammosfere e la formazione della massa tumorale in vivo. Il microambiente tumorale costituito da cellule mesenchimali staminali, adipociti, fibroblasti associati al tumore, cellule endoteliali e immunitarie, regola la staminalità, la proliferazione e la resistenza all’apoptosi delle cellule staminali attraverso la secrezione di citochine e fattori di crescita. Nel contesto del microambiente mammario, gli adipociti costituiscono la componente cellulare più abbondante e insieme ai loro fattori secreti, rappresentano i principali protagonisti nelle interazioni tra cellule stromali ed epiteliali. Tra i fattori secreti l’adipochina leptina svolge un ruolo chiave nella tumorogenesi mammaria. Inoltre, dati recentemente pubblicati dal nostro gruppo di ricerca, hanno identificato la leptina, come il principale regolatore del cross-talk tra cellule tumorali mammarie e fibroblasti associati al tumore (CAFs), aggiungendo, per la prima volta, la leptina all'elenco dei fattori di crescita in grado di mediare l’interazione tra tumore e stroma. Pertanto, sulla base di tali osservazioni, l’attenzione è stata rivolta allo studio del possibile ruolo dei fattori secreti dal microambiente tumorale, in particolare della leptina, e dei fattori intrinseci, in particolare di Notch4, nell’influenzare il comportamento fenotipico delle BCSCs. Al fine di valutare il ruolo del microambiente tumorale nella modulazione dell’attività staminale delle cellule di carcinoma mammario, sono stati utilizzati fibroblasti associati al tumore e adipociti maturi, come modelli sperimentali per le cellule stromali e cellule ER+ MCF-7 e ER- MDA-MB-231 come modello di cellule epiteliali di carcinoma mammario. Negli esperimenti di co-coltura, la presenza dei mezzi condizionati ha indotto una maggiore formazione delle mammosfere rispetto alle condizioni di base, suggerendo come fattori secreti dalle cellule stromali possano influenzare l’attività delle BCSCs. Tale risultato è completamente reversato in presenza dei mezzi condizionati depleti della leptina, individuando l’adipochina come mediatore cruciale negli effetti delle cellule stromali sulle BCSCs. Inoltre, sono stati testati gli effetti di un peptide con attività antagonista sul recettore leptinico (ObR), sintetizzato in collaborazione con il laboratorio di Chimica Organica diretto dal Prof. Liguori, sulle cellule di carcinoma mammario cresciute come mammosfere. I risultati ottenuti hanno dimostrato che, antagonizzando il recettore leptinico, l’aumentata formazione di mammosfere indotta dai mezzi condizionati stromali, è significativamente ridotta in presenza del peptide, confermando l’importanza dell’interazione leptina-ObR nel sostegno della crescita delle BCSCs. Al fine di confermare i risultati ottenuti, sono stati valutati gli effetti diretti del segnale leptinico nel mantenimento delle proprietà staminali delle cellule di carcinoma mammario. In primo luogo, è stato osservato che i livelli di mRNA del recettore della leptina risultano maggiormente espressi nelle mammosfere rispetto alle cellule coltivate in adesione. Inoltre il trattamento con leptina è in grado di aumentare significativamente la formazione delle mammosfere, il self-renewal e la popolazione con fenotipo CD44+/CD24- rispetto alle condizioni di controllo, suggerendo che tale adipochina sia direttamente coinvolta nell’induzione dell’attività staminale delle cellule di carcinoma mammario. Successivamente, analisi di microarray condotta in cellule MCF-7 cresciute come mammosfere, ha rivelato che tra i geni differentemente espressi tra il trattamento con leptina e con i mezzi condizionati delle cellule stromali, molti risultano correlati con il fenotipo staminale e con la regolazione del ciclo cellulare. È stato inoltre riscontrata una significativa up-regolazione dei geni codificanti per le heat shock proteins (HSPs), la cui attività è ormai noto essere implicata nei processi di carcinogenesi e di resistenza terapeutica in molti tipi tumorali. In seguito, gli effetti biologici della leptina sono stati saggiati in vivo, utilizzando cellule epiteliali tumorali estratte dai fluidi metastatici (liquido di drenaggio pleurico o ascitico) provenienti da pazienti con carcinoma mammario. I risultati ottenuti dimostrano che la leptina è in grado di aumentare in maniera significativa il numero di mammosfere formate rispetto alle condizioni di controllo in tutti i campioni utilizzati, e tali effetti sono completamente reversati in presenza del peptide. Come parte finale di questo studio, è stata analizzata, in diversi pazienti con carcinoma mammario (n=781), la relazione tra l’espressione genica di ObR e/o HSP90 con l’overall survival mediante analisi di Kaplan-Meier. I risultati hanno evidenziato come le pazienti con elevata espressione di ObR e di HSP90 presentano una ridotta sopravvivenza, suggerendo un loro potenziale ruolo come fattori prognostici. Successivamente è stato valutato il ruolo dei segnali intrinseci, in particolare di Notch4, nella modulazione dell’attività delle cellule staminali di carcinoma mammario nel contesto della resistenza alla terapia endocrina. In primo luogo, sono stati valutati gli effetti degli anti-estrogeni, tamoxifene e fulvestrant, sull’attività staminale, utilizzando come modelli sperimentali cellule epiteliali isolate da tumori mammari ER+, primari e metastatici. I risultati ottenuti hanno dimostrato che l’esposizione al tamoxifene è in grado di aumentare significativamente il self-renewal nella maggior parte dei campioni utilizzati. Successivamente, analisi citofluorimetriche hanno rivelato che l’attività enzimatica dell’ALDH, un altro noto marcatore di staminalità, è significativamente incrementata in seguito al trattamento con tamoxifene e fulvestrant nei campioni isolati da pazienti con tumore mammario, in modelli PDX e linee cellulari ER+. Tali dati suggeriscono che gli anti-estrogeni, somministrati per un breve periodo di tempo, sono responsabili di un’aumentata popolazione di cellule con attività staminale. In seguito, è stato osservato che l’esposizione al tamoxifene e al fulvestrant a breve termine, in modelli PDX e in cellule di carcinoma mammario recettore estrogenico positive (MCF-7, T47D, e ZR-75-1), induce un’aumentata espressione di HEY1 and HES1, geni target di Notch. Inoltre, in cellule MCF-7 resistenti al tamoxifene (TAMR) ed al fulvestrant (FULVR), generate dopo un’esposizione prolungata a tali trattamenti endocrini, è stata riscontrata un’up-regolazione dei geni target di Notch, così come una sua aumentata attività trascrizionale. Analisi di Western Blot, hanno successivamente rivelato che tra i diversi componenti della famiglia dei recettori di Notch, l’espressione di Notch4 e del suo dominio intracellulare attivo (ICD) risultano significativamente incrementate nei modelli resistenti rispetto alle cellule parentali. Inoltre, l’espressione di NOTCH4 e del suo ligando JAG 1 risultano up-regolate dal trattemento a breve termine con tamoxifene e fulvestrant sia in vivo che in vitro, suggerendo come l’attivazione di tale segnale possa rappresentare un evento iniziale nell’acquisizione della resistenza endocrina. Al fine di comprendere meglio il ruolo di NOTCH4 in tale contesto, sono stati generati cloni knock-out, utilizzando una metodica di editing genomico, recentemente descritta, chiamata CRISPR cas9. L’avvenuto knock-out, confermato mediante saggi di genotipizzazione e analisi di Western Blot, ha indotto nelle cellule MCF-7, una significativa inibizione della formazione delle mammosfere, così come una ridotta popolazione ALDH+, effetto ancora più evidente in seguito a trattamento con tamoxifene e fulvestrant. Infine, il segnale di Notch4 è stato inibito mediante l’utilizzo dell’inibitore delle gamma secretasi, RO4929097, ed è stata valutata successivamente l’attività staminale e il potere tumorigenico in vivo. I risultati ottenuti dimostrano che, nei modelli PDX, RO4929097 è in grado di abrogare l’induzione della formazione delle mammosfere, dell’attività dell’ALDH e la capacità tumorigenica, stimolate dal trattamento con anti-estrogeni. In conclusione, i risultati ottenuti in tale lavoro di tesi, identificano la leptina come un importante fattore estrinsico che media l'interazione tra le cellule stromali e le BCSCs. Inoltre, i nostri dati sottolineano l’importanza di Notch4, come fattore intrinsico, nella regolazione dell’attività staminale delle cellule di carcinoma mammario indotta dal trattamento con anti-estrogeni. Da un punto di vista clinico, tali dati suggeriscono come le strategie terapeutiche volte ad inibire il segnale leptinico e il segnale di Notch4 potrebbero rappresentare un valido approccio per l’eradicazione delle BCSCs, riducendo i fenomeni di resistenza, metastasi e di conseguenza la mortalità delle pazienti con carcinoma mammario.Item Novel molecular mechanisms involved in the stimulatory action of zinc in breast cancer(2016-11-22) Perri, Maria Grazia; Sisci, Diego; Maggiolini, MarcelloLo Zinco (Zn), minerale essenziale che regola diverse funzioni biologiche, è coinvolto nella progressione del tumore mammario. In particolare, è stato dimostrato che in seguito all’attivazione indotta dallo Zn di recettori ad attività tirosin-chinasica, come IGF-IR, EGFR e IR, vengono innescate vie di trasduzione del segnale che sono alla base della progressione tumorale, quali la via delle MAP-chinasi (MAPK) e la via del fosfatidilinositolo3-chinasi (PI3-K)/AKT. Numerosi studi hanno inoltre dimostrato il coinvolgimento di recettori accoppiati a proteina G (GPCRs) nello sviluppo dei tumori e la loro azione sinergica con vari recettori di membrana . Alla luce di tali osservazioni, una migliore comprensione dei processi attraverso cui i recettori per i fattori di crescita cooperano con segnali mediati da GPCRs potrebbe contribuire allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche volte a prevenire e/o ritardare la crescita tumorale. Nel presente studio, è stato dimostrato che lo Zn è coinvolto nel cross-talk funzionale tra IGF-IR, EGFR e GPER in cellule di tumore mammario e fibroblasti tumore-associati (CAFs). In particolare, è stato dimostrato che GPER, IGF-IR e EGFR contribuiscono agli effetti stimolatori indotti da ZnCl2 nella progressione del ciclo cellulare, nella proliferazione e nella migrazione di cellule di carcinoma mammario e dei CAFs. I nostri risultatievidenziano nuovi meccanismi molecolari attraverso i quali lo Zn può indurre effetti stimolatori in cellule di tumore mammario e nei CAF, suggerendo pertanto nuovi potenziali approcci farmacologici nel trattamento del carcinoma mammario.Item Study of the expression of a Small Leucin-Rich Proteoglycan, Asporin, in normal human osteoblasts and regulation by breast cancer cells(2014-11-17) Trombino, Giovanna Elvi; Sisci, Diego; Bellahcène, Akeila; Lanzino, MarilenaAsporin (ASPN) is an extracellular matrix protein that belongs to the Small Leucine Rich Repeat proteoglycan (SLRP) family. Asporin is abundantly expressed in the articular cartilage of individuals with osteoarthritis. In the context of osteoarthritis, several studies have shown that asporin regulates cartilage matrix gene expression and cartilage formation by modulating the transforming growth factor-β (TGF- β) signaling pathway. Asporin directly binds to TGF‐β and inhibits TGF-β-mediated expression of cartilage matrix genes. Previous studies in our laboratory, showed that Asporin inhibits TGF- β-1-mediated SMAD2 phosphorylation in breast cancer cells as well as migration and epithelial to mesenchymal transition in A549 human lung cancer cells. The present study was undertaken to investigate whether asporin secretion could indirectly mediate the ability of metastatic breast cancer cells to regulate osteoblastic differentiation. The Wnt antagonist sclerostin (SOST) is a potent inhibitor of bone formation. We considered the possibility that the balance between ASPN and SOST present in the ECM may create a specific environment favorable to aggressive breast cancer cell growth. Results: Breast cancer cells do not produce ASPN themselves but they regulate its expression in osteoblasts. Normal human osteoblasts have been cultured in presence of MCF7 and MDA-MB-231 serum-free conditioned medium. Immunoblot analysis and real time PCR, revealed a significant increase in ASPN expression and secretion in osteoblasts treated with MCF7-conditioned medium, while the opposite effect was observed with MDA-MB-231-conditioned medium. We investigated the role of MCF7 and MDAMB231 conditioned media in osteoblast differentiation and mineralization through alkaline phospatase and Runx2 expression. Our results showed the ability of MCF7 conditioned medium to induce the osteoblast differentiation and mineralization compared to the MDA-MB-231 conditioned medium treatment. Osteoblasts treated with MCF7 conditioned medium and challenged with recombinant SOST showed a significant reduction in their differentiation potential through the decrease of ASPN expression. Contrarily to non-metastatic MCF-7 breast cancer cells, MDA-MB-231 metastatic breast cancer cells inhibited the secretion of ASPN by osteoblasts through the overexpression of SOST. The result is the reduction of osteoblast differentiation and mineralization that can create a specific environment favorable to aggressive breast cancer cell growthItem L'uso di biomateriali innovativi per la veicolazione di farmaci antitumorali(2014-12-01) Tavolaro, Palmira; Sisci, Diego; Andò, Sebastiano; Panno, Maria Luisa; Tavolaro, Adalgisa