Tesi di Dottorato

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Il trasportatore di carnitina OCTN2: espressione ed implicazioni fisiopatologiche
(2010) Scalise, Mariafrancesca; Indiveri, Cesare; Sisci, Diego
In the present work we studied the plasma membrane transporter of carnitine OCTN2. We firstly investigated the interaction of this transporter with a commonly used drug, the omeprazolo. The carnitine transporter was solubilized from rat renal apical plasma membrane (brush-border membrane) with C12E8 and reconstituted into liposomes removing the detergent from mixed micelles by hydrophobic chromatography on Amberlite XAD-4. The reconstituted carnitine transporter catalysed a first-order antiport reaction of carnitine with itself or other substrates stimulated by external, not internal, Na+, with a positive cooperativity. Na+ was co-transported with carnitine. The transporter is asymmetrical and it is unidirectionally inserted into the proteoliposomal membrane with an orientation corresponding to that of the native membrane. Omeprazole externally added to the proteoliposomes, inhibited the carnitine/carnitine antiport catalysed by the reconstituted transporter. The inhibition was reversed by the treatment of the proteoliposomes by DTE indicating that the inhibition was caused by the formation of omeprazole-transporter mixed disulphide. However, omeprazole caused inhibition of the transport also in the presence of DTE, indicating a second inhibition mechanism of non-covalent nature. The presence of the substrate during the incubation of the omeprazole with the proteoliposomes increased the formation of the mixed-disulphide. Omeprazole did not inhibited when present in the internal proteoliposomal compartment, indicating that the inhibition was specifically due to interaction with the external residues or sites of the protein. Omeprazole was not found to be transported by OCTN2: the structure of the activated form of omeprazole, indeed, possess a charged pyridine group and a methoxyl oxygen at a reciprocal distance of three carbon atoms which fulfil the requirement for interaction with the active site and inhibition but not for transport. The implication of the two mechanism of inhibition of the carnitine transporter in physiopathology may be relevant in the light of the omeprazole concentration reached in the blood after administration: the inhibition by omeprazole, indeed, may lead to a carnitine deficiency-like syndrome more or less evident, depending on the dose and on the individual capacity of metabolizing the drug. In the present work we studied, also, the human isoform of OCTN2: (i) we obtained the heterologous over-expression and the purification of hOCTN2 in a bacterial host, E. coli and (ii) we evaluated the expression profile of hOCTN2 in different cancer cell lines and in keratinocytes retrotransduced with HPV16 E6E7. The cDNA coding for hOCTN2 was cloned in two bacterial expression vector and, following two different strategies, we over-expressed the hOCTN2 protein as fusion protein with GST and as hOCTN2 without any tag but with codon bias. In both cases the protein was present in the insoluble fraction of induced lysate and was, then, solubilized with a ionic detergent, Sarkosyl, together with chaotropic agent, Urea. After solubilization the protein was purified on Nichel-chelating chromatography column, obtaining the protein solubilized in Triton X- 100. In the present work we described the expression profile of hOCTN2 in different cancer cell lines and in keratinocytes immortalized by HPV16E6E7: we observed a down-regulation at mRNA levels of hOCTN2 which was reversed by treating cells with 5-aza-cytidine a DNA demetilating agent. Cells over- expressing hOCTN2 were more sensitive to the chemotherapic agent cisplatin. This observation is a preliminary result suggesting a potential role of hOCTN2 in carcinogenesis or in cancer development.
Stereoselective synthesis ofN,O-nucleosides via 1,3- dipolar cycloaddition of diacetone-D-glucose derived nitrone with vinylnucleobases Determination ofthe diglyceride content in olive oils by employing PNMR spectroscopy
(2012-11-30) Stabile, Gaetano; Maiuolo, Loredana; Gabriele, Bartolo; Bartolino, Roberto
Il lavoro svolto durante il periodo di dottorato di ricerca è stato suddiviso in due progetti: il primo incentrato sulla sintesi di analoghi nucleosidici di tipo isossazolidinici mediante l‟impiego di cicloaddizioni 1,3-dipolari, il secondo progetto basato sulla determinazione del contenuto di digliceridi negli oli d‟oliva mediante spettroscopia 31P NMR, spostando la nostra attenzione nel campo dell‟agroalimentare. Nel primo progetto come primo step, si è costruito un glicosil nitrone opportunamente protetto, a partire da uno zucchero, il diacetone D-glucosio e, successivamente, si è passati alla sua cicloaddizione 1,3-dipolare con un set di vinilnucleobasi, preparate mediante vinilazione diretta delle seguenti nucleobasi: N-1-viniltimina, N-1-vinil-5-fluorouracile, N-1-viniluracile, N-1- vinilcitosina e N-9-viniladenina. Il metodo di sintesi utilizzato, si è dimostrato soddisfacente viste le buone rese, i tempi brevi di reazione, l‟alta regiospecificità e un rapporto diastereoisomerico in favore prevalentemente dello stereoisomero eso rispetto a quello endo, riscontrando quindi una minore formazione di prodotti collaterali senza dover ricorrere ad alcun tipo di protezione delle vinilnucleobasi usate, per le cicloaddizione condotte in microonde ed in assenza di solvente. Nello stesso tempo si è cercato di sintetizzare nitroni di zuccheri a catena aperta in modo da avere degli ossidrili facilmente disponibili per successive trasformazioni. La sintesi ha previsto l‟iniziale formazione di N-benzil-Nglicosilidrossilammina a partire da N-benzilidrossilammina e 2,3,4,6-tetra-Obelzilglicopiranosio. L‟idrossilammina ottenuta, in equlibrio con la forma nitronica, è stata fatta reagire con la N-1-viniltimina, la nucleobase generalmente più attiva verso questa tipologia di sintesi. I composti ottenuti, i 4'-aza analoghi di dideossinucleosidi, già da tempo fanno parte di una classe di substrati che mostrano una potenziale applicazione nei trattamenti antitumorali e contro la diffusione di patologie di natura virale. In tempi brevi i substrati isossazolidinici ottenuti saranno sottoposti a prove biologiche per verificarne la loro attività. Questo progetto si aggiunge alla ricerca attualmente in atto presso il laboratorio di sintesi organica della Dott.ssa Loredana Maiuolo e il suo gruppo di lavoro, circa lo studio di cicloaddizioni 1,3-dipolari per la costruzione di eterocicli a cinque termini diastereoisomericamente puri. Le conoscenze e la manualità acquisita, nel primo progetto, nel campo della sintesi organica sono state utili per la messa a punto del secondo progetto che prevede, inizialmente, la sintesi di standard per la determinazione di digliceridi in oli vergini d‟oliva. I digliceridi (DG), costituenti minor dell‟olio vergine di oliva, possono essere utilizzati nella determinazione del processo di invecchiamento dell‟olio, in base all‟osservazione che un olio fresco presenta maggiori quantità di 1,2- DG e che la sua concentrazione nel tempo diminuisce per isomerizzazione nell‟1,3-DG. Sebbene non esista una regolamentazione ufficiale che stabilisca il contenuto dei vari DG nei diversi oli di oliva, è tuttavia possibile considerare che oli di oliva freschi della stessa varietà di olive siano quelli che contengono un rapporto di 1,3-DG/1,2-DG basso. La spettroscopia NMR può costituire un metodo di indagine alquanto valido nella determinazione dei digliceridi, anche se l‟applicazione di 1H e 13C NMR risulta abbastanza complessa, considerando grosse sovrapposizione di segnali prevalentemente in alcune zone dello spettro. È possibile, invece, pensare di derivatizzare il gruppo funzionale alcolico presente sulla catena diacilglicerolica mediante reagenti al fosforo e utilizzare la spettroscopia 31P NMR per identificare la presenza di 1,2-digliceridi in oli freschi e verificare analiticamente la formazione di 1,3-digliceridi rispetto all‟1,2-derivato in fase di invecchiamento dell‟olio stesso. In questo lavoro verranno illustrati le sintesi iniziali e i risultati ottenuti da uno screening con diversi composti al fosforo e la successiva applicazione del reagente che ha mostrato i migliori risultati con soluzioni standard di 1,2- DG e 1,3-DG e con alcuni campioni di olio d‟oliva calabrese monitorati mediante 31P NMR anche in diversi periodi dell‟anno.