Tesi di Dottorato
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Item Synthetic strategies towards short-chain peptides for potential biomedical applications and tumor-targeted mesoporous silica-based drug delivery systems development(Università della Calabria, 2020-04-17) Comandè, Alessandra; Andò, Sebastiano; Leggio, AntonellaMy PhD research project was focused on the design and development of short-chain peptides with biomedical applications and on the identification of new peptide synthesis strategies. Briefly, the specific objectives of my research work were the following: · Design and synthesis of novel methylated tetrapeptides acting as leptin antagonists with potentially improved stability and pharmacokinetic properties compared to the non-methylated analogue leptin antagonist LDFI. · Identification and synthesis of a novel peptide ligand able to recognize CD38, a marker overexpressed on multiple myeloma (MM) cells, for the targeted delivery of bortezomib, the drug of choice for this type of cancer. · Design and synthesis of new peptide entities to use as inhibitors linked to chelators to produce new molecular probes for prostate cancer imaging via PET. · Identification of new and efficient peptide synthesis strategies aimed at obtaining small peptides in the solution phase. The developed strategies can prove useful for obtaining biologically active peptides. · Development of a targeted MSN-based nanocarrier bearing the anticancer drug doxorubicin and grafted, on the external surface, with folic acid (FOL-MSN-DOXO). The system developed in this study provides an attractive template to develop more selective DOXO delivery systems by using peptides as targeting ligands. The present thesis consists of published work (papers) and work in progress (ongoing works) that must still be completed in order to be published in the future. Peptide sequences and their structural characterizations have been omitted in ongoing work 1 and in ongoing work 2 since a patent application is going to be filed for both products.Item Novel insight into the protective role of androgen receptor in ER-positive breast cancer(Università della Calabria, 2020-04-17) Chiodo, Chiara; Andò, Sebastiano; Lanzino, MarilenaIntroduction: Androgen receptor (AR) role in breast cancer appears to be clinically relevant and disease context specific. In estrogen receptor (ER) α-positive primary breast cancers, AR positivity correlates with low tumor grade and a better clinical outcome. These clinical-pathological findings mirror androgen capability to counteract ERα-dependent proliferation in both normal and tumor mammary epithelium. Tumor microenvironment is a key factor in cancer development and progression since the physical and hormonal paracrine exchanges with the epithelial compartment promote tumor cell proliferation and metastasis. This research project reports additional molecular mechanisms in the dynamic interplay between AR and ER-α signaling pathway in breast cancer cells and showed AR expression and role in the stroma of ER-positive breast cancers. Material and methods: MCF-7, T47D, SKBR3 breast cancer cells and cancer-associated fibroblats (CAFs) from biopsies of primary breast tumors (n=3); cell proliferation assay, transient transfection, quantitative Real Time PCR (qRT-PCR), western blotting (WB), immunoprecipitation assay (IP), chromatin immunoprecipitation assay (ChIP), RNA silencing, tunel assay, DNA affinity precipitation assay (DAPA), immunofluorescence analysis (IF), immunocytochemical staining (IHC), wound-healing scratch assay, F-actin staining assay, Boyden-chamber transmigration assay, matrigel-based invasion assay, cytokine array, zymography assay, mammosphere forming efficiency assay. Data were analyzed by ANOVA. Results: This study demonstrated an androgen-dependent mechanism through which ligand-activated AR decreased estradiol-induced cyclin D1 protein, mRNA and gene promoter activity in MCF-7 cells. This mechanism involved the competition of AR and ERα for the steroid receptor coactivator AIB1, a limiting factor in the functional coupling of ERα with the cyclin D1 promoter. Indeed, AIB1 overexpression was able to reverse the down-regulatory effects exerted by AR. Co-immunoprecipitation studies showed that AIB1 preferentially interacted with ERα or AR in relation to their intracellular levels. In addition, ChIP analysis evidenced that androgen administration decreased E2-induced recruitment of AIB1 at the AP-1 site on the cyclin D1 promoter gene. Moreover, this research project showed an increased expression of the pro-apoptotic protein BAD following androgen treatment while the levels of anti-apoptotic protein Bcl-2 as well as of the pro-apoptotic proteins BID and BAX remained unchanged. As consequence, the Bcl-2/BAD ratio was reduced, shifting the delicate balance between inhibitors and inducers of cell death. Androgen stimulation increased also BAD levels into the nuclear compartment in ERα/AR-positive MCF-7 as well as in ERα negative/AR-positive SKBR3 cells. The androgen-regulated intracellular localization of BAD involved an AR/BAD physical interaction, suggesting a nuclear role for BAD upon androgen stimulation. Indeed, androgens induced both AR and BAD recruitment at the AP-1 and the ARE sites within the cyclin D1 promoter region, contributing to explain the anti-proliferative effect of androgens in breast cancer cells. Finally, the study demonstrated AR expression and functionally activation upon androgen treatment in primary human breast CAFs. Androgen-activated AR affected CAFs secretory phenotype as evidenced by cytokine array performed on CAFs conditioned medium (CM). Co-culture experiments showed that CM from androgen-treated CAFs was less effective in stimulating MCF-7 and T47D cells motility and invasion compared to CM from untreated ones, indicating that androgens, via AR, may influence CAFs secretion of paracrine soluble factors involved in tumor cell motility and invasiveness sustainment. Conclusions: Taken together all these data showed that ligand activated AR exerts a protective role in E2-dependent breast cancer development and progression by inhibiting CD1 expression through the squelching of the steroid receptor co-activator AIB1 and the overexpression of the pro-apoptotic protein BAD. Furthermore, the study highlighted the protective role of AR in the tumor microenvironment, since activated-stromal AR affects the paracrine factors secreted by CAFs reducing ER-positive breast cancer cell migration and invasiveness. Thus, these findings reinforce the possibility to couple the androgen-based therapy with therapies targeting other important pathways in ERα-positive breast cancer patient treatment.Item Chemical modifications of polyphenols for the development of new molecules foods for the treatment of metabolic disorders(Università della Calabria, 2020-07-01) Carullo, Gabriele; Andò, Sebastiano; Aiello, FrancescaMetabolic disorders represent the principal cause of death in the industrialized world, affecting several people, because of their incorrect lifestyle. Among them, Type 2 Diabetes Mellitus and related comorbidities, such diabetic wounds, and hypertension represent the most studied examples of metabolism-associated diseases. In this context, the role of food-derived products and hybrid molecules has been investigated in this thesis. Two different braches have been investigated: one regarding food chemistry and one regarding medicinal chemistry. In food chemistry section, wine-making byproducts were used as starting point for the development of food ingredients able to modulate vascular tone in rat aortic rings. In particular, autochthonous (Calabria, southern Italy) white grape pomaces of Mantonico and Pecorello and red grape pomaces of Magliocco dolce (also known as Arvino) have been used. The pomaces were extracted in order to obtain samples, that were chemically-characterized and assayed in rat aorta rings. The results obtained and published demonstrated how these extracts were able to modulate vascular tone by a combination of antioxidant and nitric oxide-mediated effects; in the case of white pomaces, these effects were also assayed when the extract was embedded in a pectin matrix. In line with this, also a functional kefir was produced in order to evaluate its efficacy as anti-inflammatory agent for gastric epithelium, showing how the addition of the Sangiovese pomace extract was able to improve the activity of kefir. In medicinal chemistry section, the role of polyphenols, present in food products, was evaluated in order to drive their activity versus specific molecular pathways. In this field, we used quercetin, in combination with oleic acid, developing GPR40/FFA1 agonists that demonstrated to be useful insulin secretagogue agents. In particular, one derivative was also assayed in wound healing models, demonstrating the role of the receptor also in this proliferation process. In line with this, the GPR120/FFA4 demonstrated interesting pharmacological activities. Their agonists were able to modulate incretin secretion, with interesting anti-diabetic effect. Nevertheless, little structural determinants are present in literature. In this context, in my Spanish experience at University of Seville, I isolated (S)- pinocembrin from honey, and decided to create molecular hybrids, according to a homology model published. The hybrids obtained demonstrated a useful GPR120 agonist activity, promoting wound healing in HaCaT cell line. Furthermore, quercetin and morin were used as template for the development of new KCa1.1 and Cav1.2 channel modulators, with the aim of obtaining new suitable anti-hypertensive candidates. The results obtained showed how quercetin derivatives maintain their activity versus KCa1.1 channel, while morin derivatives demonstrated to activate KCa1.1 channel, behavior not registered in the case of parent compound. These results are now under review for publication.Item Advanced functionalized materials for multipurpose applications(Università della Calabria, 2021-03-21) Pantuso, Elvira; Andò, Sebastiano; Nicoletta, FioreItem Sistemi polimerici multicomponente per la veicolazione di principi attivi(Università della Calabria, 2021-02-25) Farfalla, Annafranca; Andò, Sebastiano; Iemma, FrancescaL’attività di ricerca riportata nel presente lavoro di tesi di dottorato si inserisce nel contesto della sintesi e caratterizzazione di materiali multifunzionali per la veicolazione e il direzionamento di principi attivi. Nello specifico, all’interno del panorama di materiali proposti per il drug delivery, l’interesse è stato incentrato sulla realizzazione di sistemi multicomponente costituiti principalmente da due classi di materiali: i sistemi polimerici di natura organica e le nanostrutture al carbonio di natura inorganica. Per quanto riguarda la componente polimerica sono stati presi in considerazione sistemi macromolecolari coniugati ottenuti mediante derivatizzazione funzionale di polimeri di origine naturale, quali polisaccaridi (chitosano e destrano) e proteine (gelatina e albumina serica umana), con polifenoli dalle note attività antitumorali e antibatteriche quali curcumina e quercetina. L’inserimento di tali bioconiugati in idrogel o sistemi nanoparticellari ha permesso di ottenere sistemi di rilascio funzionali per la veicolazione di principi attivi in cui l’attività biologica è riconducibile non solo al farmaco trasportato ma anche alle caratteristiche del carrier. Per la componente inorganica sono stati presi in considerazione i Nanotubi di carbonio a parete multipla (MWCNT) e il grafene Ossido (GO) che, grazie alle loro proprietà di elevata affinità per molecole farmacologicamente attive, rapida internalizzazione cellulare e conducibilità elettrica, permettono, quando vengono inseriti nei veicoli funzionali precedentemente descritti, di realizzare sistemi per il trasporto mirato di farmaci ad elevata efficienza e in grado di modulare il rilascio di un principio attivo in seguito all’applicazione di un campo elettrico e magnetico. In questo modo è stato possibile ottenere materiali innovativi con proprietà superiori a quelle dei singoli componenti che, date le funzionalità biologiche selezionate, sono stati sintetizzati e proposti per il trattamento delle ferite cutanee e di diversi tipi di tumori solidi quali carcinoma mammario, neuroblastoma e glioblastoma. L’attività di ricerca è stata svolta nell’ambito di collaborazioni nazionali ed internazionali attive presso il gruppo di ricerca di Tecnologie Farmaceutiche e Cosmetologiche del dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione con la Charité – Universitätsmedizin Berlin (Germania), il Leibniz Institute of Solid State and Material Research Dresden (Germania), l’University of New South Wales (Sydney, Australia), e il Dipartimento di Biologia dell’Università di Pisa. Tale attività si è articolata nello studio, realizzazione e caratterizzazione dei seguenti materiali compositi: 1) Idrogel ibridi elettrosensibili. Idrogel contenenti grafene ossido e gelatina o tripsina e caricati con curcumina sono stati proposti come strumento per il trattamento delle ferite cutanee. Il GO conferisce stabilità termica e meccanica al reticolo polimerico, nonché un’elevata elettrosensibilità che consente la modulazione dell’entità e della cinetica di rilascio in funzione delle diverse esigenze terapeutiche La presenza dei materiali proteici, gelatina e tripsina, assicura elevati livelli di biocompatibilità all’idrogel finale, come evidenziato dagli studi morfologici effettuati sucellule MRC-5 incubate in presenza dei materiali di medicazione nei quali non viene registrata alcuna variazione strutturale. Nel caso degli idrogel contenenti tripsina, il mantenimento dell’attività proteolitica all’interno del reticolo polimerico ha permesso di ampliare le potenzialità applicative dei dispositivi ibridi ai casi in cui è richiesta la degradazione delle proteine nel sito di guarigione. Il rilascio da questi materiali della Curcumina si è rivelata una strategia utile per realizzare un dispositivo funzionale in grado di preservare il sito di guarigione dalle infezioni microbiche. 2) Idrogel multifunzionali con attività antiossidante Idrogel il cui rigonfiamento dipende dalla variazione di stimoli esterni a base di un coniugato chitosano-quercetina sono stati proposti come dispositivi in grado di modulare il rilascio di molecole bioattive in risposta a variazioni di pH e temperatura. La sensibilità alle variazioni di temperatura ha permesso anche di modulare le proprietà antiossidanti della quercetina, sfruttando le transizioni di fase volumetrica, mentre le variazioni di pH si sono dimostrate più efficaci nel modulare il rilascio: a pH 2.0, il maggior rilascio si è registrato a 40°C, mentre a pH 7.0 la contrazione dell’idrogel diventa predominante. 3) Sistemi compositi idrogel/microparticelle È stato realizzato un sistema composito idrogel/microparticelle. L’idrogel, formato da un network polimerico ottenuto dalla polimerizzazione radicalica tra monomeri acrilici e un coniugato gelatina-curcumina, è stato progettato per garantire il mantenimento di un ambiente umido e per fornire protezione dalla tossicità dei ROS agendo, allo stesso tempo, come supporto per la crescita cellulare. La porzione microparticellare, costituita da cheratina lipidizzata autoassemblante caricata con quercetina, ha lo scopo di promuovere la proliferazione cellulare e controllare il rilascio del polifenolo ad attività antimicrobica, preservando così il sito di guarigione dalle infezioni. I risultati complessivi possono essere considerati un valido punto di partenza per rispondere alle esigenze chiave di un dispositivo funzionale in grado di promuovere il processo di guarigione delle ferite cutanee. 4) Nanoparticelle autoassemblanti È stato realizzato un sistema nanoparticellare a partire da un coniugato destrano-curcumina con proprietà autoassemblanti per la veicolazione del metotrexato all’interno di cellule di carcinoma mammario. Il profilo di rilascio di MTX è risultato prolungato nel tempo come conseguenza dell’incapsulamento del farmaco; i saggi di vitalità cellulare in vitro hanno mostrato chiaramente il potenziamento dell’attività citotossica sia per la presenza dei residui di curcumina immobilizzati che per la rapida internalizzazione delle nanoparticelle nelle cellule tumorali. 5) Nanoibridi a base di nanotubi di carbonio Sistemi nanoparticellari a base di MWCNT rivestiti di chitosano sono stati proposti come dispositivi per il rilascio pH sensibile del metotrexato all’interno di cellule di carcinoma polmonare. L’estesa caratterizzazione chimico-fisica del nanoibrido ha permesso di evidenziare il corretto assemblaggio delle controparti organiche e inorganiche, mentre quella biologica in vitro ha dimostrato che, il sistema nanoparticellare è in grado di agire in maniera sinergica con il metotrexato in cellule tumorali con caratteristiche di pH peculiari, riducendo la tossicità del farmaco rispetto alle cellule sane. 6) Nanoibridi a base di grafene ossido e nanoparticelle magnetiche di maghemite Sono stati realizzati materiali sensibili all’applicazione di un campo magnetico per la veicolazione sito specifica di cisplatino all’interno di cellule di glioblastoma combinando nanoparticelle γ-Fe2O3 su foglietti di GO. I risultati dimostrano la possibilità di ottenere un rilascio prolungato del CisPt e un efficace targeting magnetico nelle cellule tumorali con ridotta tossicità a carico delle cellule sane. 7) Nanoibridi funzionali a base di grafene ossido È stato progettato e realizzato un nanoibrido a base di ossido di grafene, nanoparticelle magnetiche di magnetite e un coniugato albumina serica umana – curcumina in grado di controllare la veicolazione sito-specifica di agenti citotossici come la doxorubicina. La strategia sintetica si è articolata in due fasi: nella prima fase il coniugato polimerico e il sistema grafene-magnetite sono stati preparati rispettivamente tramite catalisi enzimatica e reazione di coniugazione covalente. Successivamente i due sistemi sono stati assemblati per formare il nanoibrido finale. Il profilo di rilascio è risultato essere pH sensibile, come conseguenza della modulazione dell’affinità farmaco-carrier, mentre i risultati dei test di vitalità su cellule di neuroblastoma hanno dimostrato il potenziamento dell’attività citotossica della doxorubicina in presenza di curcumina nel rivestimento. La capacità di essere internalizzato dalle cellule, unita alla possibilità di ottenere una concentrazione locale del farmaco sotto l’applicazione di un campo magnetico esterno, rende il nanosistema proposto un vettore promettente per il trattamento del neuroblastoma. La tesi ha affrontato i diversi aspetti dei sistemi proposti per la veicolazione sito-specifica e il rilascio controllato di farmaci. Analizzando le proprietà dei diversi componenti utilizzati, è stato possibile evidenziare le peculiarità di ogni sistema (idrogel e nanoparticelle) e materiale (coniugati polimerici e nanostrutture al carbonio) che ne permettono la combinazione in materiali multifunzionali che ben si adattano alle specifiche esigenze applicative.Item Evidence that ANG II/AGTR1 signaling stimulates aromatase activity, enhances local estrogen production involved in Glioblastoma cell growth and progression(Università della Calabria, 2021-04-01) Russo, umberto; Andò, Sebastiano; De Amicis, FrancescaItem Progesterone Receptor B disrupts the metabolic reprogramming in breast cancer cell lines producing death by blocking energy producing pathways, and p53 may be linked in this tumour suppressive-action(Università della Calabria, 2021-11-10) Santoro, Marta; Andò, Sebastiano; Aquila, SaveriaIl carcinoma mammario (BC) rappresenta la più comune causa di morte per neoplasia nella donna. Nonostante i progressi fatti nella diagnosi precoce e nella terapia, esso resta una delle forme tumorali con prognosi infausta. Ciò può dipendere dalla sua notevole eterogeneità, infatti, il BC è classificato in diversi sottotipi in base alle caratteristiche istologiche, metaboliche, genetiche e molecolari. In particolare, le forme ormono-resistenti risultano le più aggressive, chemioresistenti e difficilmente curabili. Pertanto, è necessaria l'individuazione di nuove strategie terapeutiche. Gli ormoni sessuali steroidei, tra cui l’estradiolo (E2) ed il progesterone (PRG) (Fuqua SAW et al., 2004), svolgono un ruolo importante nello sviluppo normale della ghiandola mammaria, e si ritiene che la progressione del cancro al seno sia influenzata da tali steroidi e dai loro recettori (Clarke CL et al., 1990, Dunnwald LK et al., 2007). Sebbene l’azione dei recettori per gli estrogeni nella carcinogenesi del seno, è stata oggetto di intensa indagine, non è ancora chiaro, anzi è controverso, il ruolo dei recettori per il PRG (PRs) (Horwitz KB 1987). Un decremento dei livelli di espressione dei PRs è generalmente associato con la progressione del carcinoma mammario. I PRs appartengono alla sottofamiglia dei recettori steroidei nucleari classici, e comprendono due isoforme, denominate PR-A e PR-B (Kastner P et al., 1990). Da modelli sperimentali emerge che i tumori al seno PR+ sono ben differenziati, a basso rischio di recidiva mentre tumori PR- sono metastatici e presentano un decorso più aggressivo dopo la perdita di PR-B rispetto ai tumori che lo esprimono. I dati dimostrano che i pazienti con tumori PR+ ma con prevalenza dell’isoforma A, hanno una probabilità di recidiva circa 3 volte maggiore rispetto ai pazienti con prevalenza di PR-B, e ciò risulta correlato alla resistenza al tamoxifene (TAM). Nell’ultima decade sono stati identificati geni e pathways trasduzionali coinvolti nella resistenza endocrina e recentemente il metabolismo cellulare è considerato un innovativo target per le terapie anti-tumorali. È noto che molti segnali oncogenici alterano il metabolismo cellulare allo scopo di sostenere la crescita e la sopravvivenza della massa tumorale. La cellula tumorale esprime un metabolismo peculiare che è tuttora oggetto di indagine in quanto numerosi studi hanno anche evidenziato che le cellule tumorali possono vivere in un ampio spettro di stati bioenergetici che variano dalla predominanza del fenotipo glicolitico fino a quello parzialmente o totalmente fosforilativo. Il glucosio viene metabolizzato sia attraverso la glicolisi che lo Shunt dei Pentoso Fosfato (PPP), di tali vie la cellula cancerosa non metabolizza il glucosio solo per sostenere la richiesta di ATP o per incrementare la sintesi di acidi nucleici e di NADPH (necessario alla sintesi di acidi grassi ed alla rigenerazione del glutatione ridotto), utilizza anche direttamente gli intermedi di tali pathways metabolici. In un nostro precedente studio, abbiamo dimostrato che il 17OH-progesterone (OHPg) tramite il suo recettore PR-B è in grado di attivare il gene PTEN. PR-B e PTEN cooperano nell’indurre la morte tramite autofagia nelle cellule di tumore mammario (De Amicis F et al., 2014). Allo scopo di investigare altri tumour-suppressive pathways attraverso cui OHPg/PR-B svolge un’azione protettiva nel tumore al seno, abbiamo deciso, in questo progetto, di valutare un suo possibile ruolo nel metabolismo delle cellule tumorali ed un suo possibile link con un altro noto oncosoppressore, ossia il gene p53 che svolge anche un ruolo chiave nel metabolismo delle cellule tumorali. Ad oggi, nessun dato in letteratura ha riportato un ruolo di OHPg/PR-B sulla riprogrammazione metabolica di cellule di tumore mammario, nè una sua possibile cooperazione in tale azione con la p53.Item Application of computational methodologies toward the identification of novel therapeutics and photodegradation studies for the design of light-stable formulations(Università della Calabria, 2021-06-10) Occhiuzzi, Maria Antonietta; Andò, Sebastiano; Grande, Fedora; Iole, GiuseppinaItem Charatterization of store-operated calcium entry in the neuroimmune response evoked by ischemic preconditioning in mice subjected to middle cerebral artery occlusion(Università della Calabria, 2021-06-10) Frisina, Marialaura; Andò, Sebastiano; Amantea, DianaCerebral ischemia is one of the leading causes of death and long-term disability worldwide. Currently approved therapies for ischemic stroke are limited to reperfusion through mechanical recanalization and/or pharmacological thrombolysis; however, only a small percentage of eligible patients may benefit from this treatment due to its contraindications and, furthermore, it does not provide neuroprotective effects. In this context, several studies have highlighted the potential of inducing ischemic tolerance by stimulating endogenous neuroprotection. To this aim, brain ischemic preconditioning (PC), namely a sublethal ischemic event able to increase the resistance of the brain against a subsequent, more intense ischemic insult, has been considered as a useful experimental paradigm to investigate the mechanisms implicated in brain tolerance. A deep comprehension of endogenous neuroprotection elicited by ischemic PC represents a promising approach to identify novel targets that can be translated into stroke therapy. One of the main factors involved in the progression of neuronal damage during cerebral ischemia is the alteration of cellular Ca2+ homeostasis. Indeed, cytosolic Ca2+ overload due to increased membrane permeability or to its leak from intracellular organelles could result in neuronal demise. Detrimental effects involve the activation of a series of Ca2+-dependent enzymes that degrade cellular components or activate death pathways, and the formation of cytotoxic products that cause irreversible mitochondrial damage and cellular demise. The main objective of the present research work was to investigate the involvement of store-operated calcium entry (SOCE) in brain ischemia and ischemic preconditioning in mice subjected to focal cerebral ischemia. Following an ischemic insult and depletion of Ca2+ stores, the endoplasmic reticulum Ca2+ sensor stromal interaction molecule (STIM)1 interacts with the Ca2+ selective plasmamembrane channel Orai1, to promote SOCE, that may protect neurons by re-establishing Ca2+ homeostasis or could also be the source of excessive Ca2+ influx, thus causing nonexcitotoxic neuronal death. This Ca2+ influx is regulated by SOCE-associated regulatory factor (SARAF) that associates with STIM1 and promotes a slow Ca2+- dependent inactivation of SOCE, or directly interacts with Orai1 to promote SOCE activation in the absence of STIM1. Furthermore, SOCE represents the main source of Ca2+ in immune cells, regulating several of their critical functions. Besides the pivotal role played by immune mediators in the evolution of cerebral ischemic damage, it has been demonstrated that the innate immune system is also an essential component of the delayed ischemic tolerance elicited in the brain by ischemic PC. Therefore, we investigated whether central and peripheral innate immune responses contribute to PC-induced ischemic tolerance and if modulation of different SOCE components occurs in ischemic damage (1h middle cerebral artery occlusion, MCAo, followed by 24h of reperfusion) and/or in neuroprotection conferred by ischemic PC (15 min MCAo, 72h before) in C57BL/6J adult male mice. Ischemic PC significantly reduced histological damage and neurological deficits produced in mice by a more severe ischemia of 1h. Western blot analysis revealed that Orai1 expression is not affected by the ischemic insult preceded or not by the PC stimulus in the frontoparietal ischemic cortex. However, Orai1 expression was detected in neurons, but also in Ly6B.2+ myeloid cells infiltrating the ischemic hemisphere. By contrast, STIM1 and SARAF expression, mainly found in NeuN+ neurons, was significantly reduced in the ischemic cortex. Interestingly, ischemic PC prevented SARAF downregulation in the ischemic cortex, thus suggesting that this regulatory factor may play a crucial role in SOCE-mediated tolerance. To assess the immunomodulatory effects of ischemic PC, we performed ELISA assay to demonstrate that cerebral damage was associated with increased protein levels of the proinflammatory cytokine IL-1β in the ischemic cortex, while this effect was prevented by the PC stimulus. Regarding alternatively-activated phenotypes, western blot analysis revealed a significant elevation of the expression of Ym1, marker of M2-polarized microglia/macrophages, in the ischemic cortex as compared to contralateral tissue. Interestingly, ischemic PC further increased Ym1 expression in the ipsilateral cortex as compared to MCAo group. Immunohistochemical analysis revealed that the majority of Ym1+ cells are mainly amoeboid CD11b+ myeloid cells, very likely monocytes/macrophages infiltrating from blood vessels. Thus, elevated brain infiltration of these phenotypes is very likely involved in the protective effects of ischemic PC. The involvement of the peripheral immune response was confirmed by the evidence that the 70% increase in spleen weight observed after 1h MCAo was abolished in mice pre-exposed to PC. Accordingly, flow cytometry analysis revealed that PC significantly attenuates elevation of neutrophil counts (Ly-6G+ events) induced by 1h MCAo in blood. Since the Ca2+-selective plasmamembrane channel Orai1 is crucial in the recruitment of immune cells during inflammation, we have analysed its expression in the whole population of circulating leukocytes and in neutrophils, demonstrating that the number of Orai1+ cells, mainly corresponding to Ly-6G+ neutrophils, was significantly enhanced in the blood after the ischemic insult, as compared to sham, regardless of whether mice received or not ischemic PC. In conclusion, this research project reaffirms that cerebral ischemic tolerance induced by PC involves both central and peripheral modulation of the innate immune system, further underscoring the relevance of exploiting immunomodulatory approaches for the development of effective stroke therapies and originally demonstrates that preventing SARAF downregulation could represent an important neuroprotective mechanism aimed at preserving SOCE functions, making SARAF a valuable target to protect neurons from the ischemic damage.Item A computational mechanistic study of potentially evolving platinum based anticancer drugs(Università della Calabria, 2021) Dabbish, Eslam; Andò, Sebastiano; Sicilia, EmiliaMetals are known to play a fundamental physiological role inside human body affecting many of the biological functions. Analogously, metal based drugs can also have a similar impact. Cisplatin, a simple platinum complex, is well known to be a cytotoxic agent and the first approved and most widely used metal based drug for fighting cancer. Currently, used platinum containing anticancer agents namely cisplatin, carboplatin and oxaliplatin suffer from serious toxic side effects as well as acquired and inherent drug resistance against many types of cancer. Consequently, new platinum anticancer drug families evolved to overcome the current limitations of traditional platinum drugs. Monofunctional platinum complexes, Pt(IV) complexes, platinum complexes targeting mitochondria, platinum idodio derivatives and photoactivated platinum compounds are examples of some of such newly developed platinum based cytotoxic families. Computational chemistry has strongly grown over the past years with both the increase in computers capabilities and the development of new theories and efficient algorithms that can allow to handle bigger models in a reasonable time. Molecular modelling can give a wealth of information about the studied systems in terms of energies, electronic properties, geometries, conformations, structure/activity relationships, reaction mechanisms and many others. By using quantum mechanical methods like Density Functional Theory (DFT) and its time-dependant formulation TD-DFT and molecular dynamics (MD) computational tools, the mechanism of action of some selected examples of non-traditional platinum anticancer drug families have been studied in this thesis. Phenanthriplatin is the most effective member of a new class of platinum anticancer agents (7-40 times more active than cisplatin) known as monofunctional platinum anticancer drugs. In addition, it has started its clinical trials phase. Our computational mechanistic study of phenanthriplatin highlighted the importance of the role played by its unique chemical structure in the drug activation, interaction with DNA and transcription blockage. Targeting of mitochondrial DNA by means of platinum drugs can lead to mitochondrial dysfunction in cancer cells that causes tumour cells growth inhibition and apoptosis. We have undertaken a comparative study between three different isomers of a recently prepared triphenyl phosphonium modified monofunctional platinum complexes for their mechanism of action. Pt(IV) complexes are prodrugs that are reduced inside the body by means of abundant biological reducing agents like ascorbic acid to release the equivalent cytotoxic Pt(II) complexes. This reduction step is considered to be the limiting step for the activity of such class of drugs. In a series of studies, we have carried out a detailed mechanistic study to understand the relation between the nature of Pt(IV) complexes axial and equatorial ligands and the extent and mechanism of reduction by means of ascorbic acid at physiological pH. We highlighted the particular importance and impact of the nature of axial ligands on the reduction process. Photoactivated chemotherapy (PACT) technique allows the localized activation of drugs by means of specific wavelength light. A recently synthesized complex named platicur is a cis-diammineplatinum(II) complex of curcumin in which the Pt(II) centre is bound to a curcumin molecule as the leaving ligand. Upon light irradiation curcumin molecule is released together with the doubly aquated Pt(II) complex that can exert the required cytotoxic effect. In our study, we have provided a deep insight in the photoactivated excited states and their role in the photocleavage mechanism with the release of curcumin.