Tesi di Dottorato

Permanent URI for this communityTesi di Dottorato

Browse

Author: search.filters.author.Canonaco, MarcelloSubject: search.filters.subject.Fisiologia

Search Results

Now showing 1 - 2 of 2
  • No Thumbnail Available
    Item
    Effect of different formulations of magnesium chloride, used as anaesthetic agents, on the performance of the isolated heart of Octopus vulgaris
    (2017-01-17) Pugliese, Chiara; Canonaco, Marcello; Gattuso, Alfonsina; Mazza, Rosa
    Il cloruro di magnesio (MgCl2) rappresenta l'anestetico più comunemente utilizzato per i cefalopodi; tuttavia, i suoi effetti fisiologici compresi quelli a livello cardiaco non sono ben caratterizzati. Nel presente studio, utilizzando come modello sperimentale il polpo comune Octopus vulgaris, è stato valutato mediante la tecnica del cuore isolato e perfuso: a) se l'esposizione dell’animale in vivo (immersione) a diverse formulazioni di MgCl2 induce effetti sulla funzione cardiaca in vitro che potrebbero danneggiare il recupero dall'anestesia; b) l’effetto diretto della perfusione con diverse formulazioni di MgCl2 sulla funzione cardiaca. Per gli esperimenti in vivo, sono state utilizzate le seguenti formulazioni con relativi tempi di esposizione: i) MgCl2 3,5% in acqua di mare (MgCl2 sw, 20min); ii) MgCl2 3,5% (1:1, acqua di mare:acqua distillata, 20min); miscela di MgCl2 (1,12%) + etanolo (1%) (Mix, 20min e 45min); ipotermia (4°C, 5-10min). Alle condizioni basali, i cuori prelevati dopo esposizione ai vari trattamenti anestetici, inclusa l’ipotermia, sono stati in grado di lavorare con carichi emodinamici simili a quelli in vivo e di produrre valori fisiologici di gittata sistolica. In condizioni di carico emodinamico (incrementi di precarico), i cuori rimossi da animali esposti in vivo ad MgCl2 sw (20min) o al Mix (20min) hanno mostrato una performance cardiaca (in termini di risposta di Frank-Starling) comparabile a quella di animali anestetizzati mediante ipotermia. Al contrario, sia l'esposizione a MgCl2 (1:1, 20min), che al Mix (45min) ha mostrato un significativo deterioramento della risposta di Frank-Starling in termini di ridotta capacità di rispondere agli incrementi di precarico. Dopo esposizione ad ipotermia, la perfusione dei cuori isolati con concentrazioni crescenti delle diverse formulazioni di MgCl2, ha prodotto un effetto bradicardico dose-dipendente (e in alcuni casi arresto cardiaco) ed una riduzione della gittata cardiaca e del volume sistolico, indicativi di un effetto diretto dei trattamenti anestetici sul cuore. Al contrario, la perfusione con dosi crescenti di solo etanolo non ha causato alcuna variazione della frequenza cardiaca, indicando che l’effetto bradicardico evidenziato con la soluzione Mix è attribuibile al cloruro di magnesio. L'espressione di HSP70 e caspasi-3, e la fosforilazione di JNK e p38MAPK sono stati determinati in omogenati cardiaci, ottenuti da esemplari di O. vulgaris esposti alle diverse formulazioni di cloruro di magnesio o ad ipotermia (4°C). I risultati hanno evidenziato un incremento dell’espressione di HSP70 (ma non della caspasi-3); in particolare, l’espressione di HSP70 è risultata essere inferiore nei cuori prelevati da animali esposti ad ipotermia, rispetto a quelli esposti alle diverse formulazioni di MgCl2. Tra questi ultimi, nessuna differenza quantitativa è stata evidenziata tra le diverse formulazioni, ad eccezione del Mix 45min, effetto dovuto probabilmente al maggior tempo di esposizione. L'aumento della fosforilazione di JNK e p38MAPK, parallelo all'aumentata espressione di HSP70, lascia supporre il coinvolgimento di queste MAPKs nell'espressione di HSP70. Nell'insieme i dati dimostrano che, a condizione che l'esposizione in vivo al 3,5% di MgCl2 in acqua di mare o ad una miscela di MgCl2+etanolo sia limitato a ~ 20min, gli effetti residui sulla funzione cardiaca non influenzano il recupero post-anestesia. Inoltre, l’espressione di HSP70 che può giocare un ruolo citoprotettivo nella risposta allo stress durante l'anestesia, parallela alla mancata espressione della caspasi-3 in tutti i tessuti analizzati, permette di escludere eventi pro-apoptotici da parte di tutti i trattamenti anestetici. Nell’insieme questi risultati possono contribuire alla discussione circa le pratiche anestesiologiche da utilizzare anche in relazione all'applicazione della nuova Direttiva 2010/63 / UE per i cefalopodi.
  • No Thumbnail Available
    Item
    I nitriti come molecola segnale: effetti diretti e indiretti sulla regolazione dell'attività cardiaca
    (2012-11-20) Montesanti, Gabriella; Cerra, Maria Carmela; Canonaco, Marcello; Pellegrino, Daniela
    Nitrite anion is a physiological NO storage form and an alternative way for NO generation, recently emerged as a cardioprotective endogenous modulator. Using Langendorff perfused rat hearts, as paradigms of mammals heart, we explored nitrite influence on the Frank-Starling response. We demonstrated that, like NO, exogenous nitrite improves the Frank-Starling response in rat heart as indicated by Left Ventricular Pressure (LVP) and the maximal rate of LVP decline (LVdP/dtmax), used as indexes of inotropism. Noteworthy, the minimal negative derivative of intraventricular pressure, LVdP/dt min, used as indexes of lusitropism, was positively affected by nitrite, suggesting the anion involvement not only in the systolic but also in the diastolic phase. This positive influence of nitrite was unaffected by endocardial endothelium impairment and NOS inhibition. In addition, the effect resulted sensitive to NO scavengers, independent on nitroxyl anion, and mediated by a cGMP/PKG-dependent pathway. These results suggest that nitrite acts as a physiological source of NO modulating the stretch-induced intrinsic regulation of the mammals heart. Moreover, nitrite affects numerous biological processes through NO-independent pathways (Bryan et al., 2005), including the S-nitrosylation of thiol-containing proteins (Foster et al., 2003). The mechanisms underlying these phenomena, until now not fully understood, are of great interest because of their cardiovascular therapeutic potential. In the last part of this study we analysed in the rat heart whether nitrite affect S-nitrosylation of cardiac proteins and the potential targets for S-nitrosylation. Rat hearts, perfused according to Langendorff, were exposed to nitrite and then analysed by Biotin Switch Method. We showed that nitrite increased the degree of S-nitrosylation of a broad range of membrane proteins. Further analysis, conducted on subfractioned proteins, allowed us to identify a high level of nitrosylation in a small range of plasmalemmal proteins (45-50 kDa). The increment in S-nitrosylation at this location was characterized by using an anti-Kir2.1 rabbit polyclonal antibody. We also verified that this effect of nitrite is preserved in the presence of the NO scavenger P-TIO. Finally, we wanted to investigate the direct effects of nitrite using two specific inhibitors of the major nitrite reductase in the heart, xantine oxidoreductase and citocrome P450 (allopurinol and ketoconazole respectively). The effect of nitrite in the presence of these inibitors is a bit reduced compared to control. A further analysis of this result, we used nitrite in the presence of N-acetyl-L-cysteine (NAC), a specific inhibitor of the nitroxyl anion (HNO). In this case, unlike that observed with the P-TIO, the effect of nitrite is significantly reduced. Our results suggest, for the first time, that nitrite represents a direct S-nitrosylating agent in cardiac tissues and that Kir2.1 channels are one of the targets. These observations are of relevance since they support the growing evidence that nitrite is not only a NO reserve but also a direct modulator of important functional cardiac proteins