Tesi di Dottorato

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Author: search.filters.author.Canonaco, MarcelloSubject: search.filters.subject.Teleostei

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    Effetti neuro-comportamentali del rame nei teleostei: ruolo dell'HSP90 e del sistema ORXergico
    (2012-11-29) Zizza, Merylin; Cerra, Maria Carmela; Canonaco, Marcello; Facciolo, Rosa Maria
    Tra i metalli, il rame (Cu2+), sebbene essenziale per il corretto metabolismo corporeo, può risultare un potente agente tossico in grado di promuovere pericolosi eventi nocivi, soprattutto nei pesci. Ad oggi, sono poche le informazioni sulla neurotossicità ramedipendente e le risposte attivate per la difesa e riparazione da tale tossicità. Su questi presupposti, nel presente lavoro sono stati investigati gli effetti del cloruro di rame (CuCl2), a diverse concentrazioni e tempi di esposizione, sia a livello comportamentale che neuronale nel teleosteo d’acqua dolce, Carassius carassius, e marino, Thalassoma pavo. Da un punto di vista molecolare, l’attenzione è stata indirizzata alle variazioni trascrizionali dell’Heat Shock Protein 90 (HSP90), chaperon con ruolo critico sia in condizioni fisiologiche che di stress. Alla luce di recenti evidenze che propongono il sistema orexinergico come cruciale nella coordinazione delle reazioni fisiologiche allo stress, è stata valutata anche la capacità dell’orexina-A (ORX-A), somministrata ogni giorno intraperitonealmente (10 ng/g peso corporeo) durante l’esposizione al Cu2+, di modulare gli effetti neuro-comportamentali di tale metallo nei suddetti teleostei. Il trattamento a breve termine (48h) con due concentrazioni di metallo, selezionate mediante screening preliminari in Carassius carassius (1.45 mg/L e 0.30 mg/L CuCl2) e Thalassoma pavo (1.07 mg/L e 0.25 mg/L CuCl2), ha causato evidenti alterazioni comportamentali. In particolare, il feeding è risultato notevolmente (p<0.001; p<0.01) ridotto, vs i controlli, in Carassius carassius e in Thalassoma pavo, rispettivamente. Nel primo pesce, la concentrazione di 1.45 mg/L ha causato anche una moderata (p<0.05) riduzione dello swimming, accompagnata da un simultaneo incremento del resting state. In modo analogo, in Thalassoma pavo, la riduzione dello swimming durante l’esposizione alla più bassa concentrazione, si è tradotta in un concomitante incremento del resting state. Nei teleostei marini, esposti a 1.07 mg/L di metallo, l’assenza di effetti significativi sul rest era dovuta alla comparsa di abnormal motor behaviors, caratterizzati da perdita di equilibrio e movimenti repentini ed improvvisi. In Carassius carassius tali atteggiamenti insorgevano solo moderatamente dopo 48h di esposizione alla alta concentrazione. Inoltre, durante l’esposizione, entrambi i teleostei mostravano una considerevole tendenza a nuotare verso la superficie (swimming towards surface). Accanto agli effetti sul comportamento, l’Amino Cupric Silver Stain ha anche mostrato segni di neurodegenerazione a carico dei neuroni, soprattutto nel nucleo laterale del telencefalo dorsale (Dl) degli esemplari esposti alle alte concentrazioni di contaminante. Parallelamente, l’ibridazione in situ ha fatto registrare nell’encefalo di Thalassoma pavo, trattato con la concentrazione più alta, un’up-regulation dell’HSP90 in differenti nuclei, come Dl (+87%). In Carassius carassius la risposta trascrizionale è stata invece meno evidente, con moderati incrementi dell’mRNA rinvenuti, ad esempio, nella valvola del cervelletto (VCe; +31%), in seguito a trattamento con la più alta concentrazione che causava anche moderate down-regulations a livello del telencefalo. E’ stato interessante notare che molte delle alterazioni comportamentali venivano ridotte dalla somministrazione di ORX-A, soprattutto a livello del feeding di entrambi i teleostei. In Carassius carassius si è potuto osservare, inoltre, una riduzione degli abnormal motor behaviors e dello swimming towards surface. Anche a livello neurodegenerativo, l’ORX-A è stata in grado di prevenire i danni indotti dal Cu2+, come nel Dl di Carassius carassius esposto alla più alta concentrazione. Dal punto di vista molecolare, l’ORX-A ha prevenuto la down-regulation indotta dal metallo in Dl, favorendo addirittura una moderata up-regulation del trascritto in TLo (+32%) di Carassius carassius esposto a 1.45 mg/L di CuCl2, rispetto ai controlli. Anche in Thalassoma pavo, il neuropeptide induceva una significativa up-regulation dell’espressione di HSP90, come nel nucleo laterale del telencefalo ventrale (Vl; +92%) durante esposizione alla concentrazione più bassa di CuCl2. Quando i pesci esposti al Cu2+ per 48h sono stati trasferiti in acqua priva di metallo, molti deficit neuro-comportamentali erano, almeno parzialmente, ripristinati. Inoltre, quasi tutti i nuclei encefalici di entrambi i teleostei, esposti alla più alta concentrazione, hanno mostrato incrementi significativi dell’mRNA per l’HSP90, sia rispetto al precedente trattamento che ai controlli. Alla luce dei dati ottenuti e in virtù del fatto che la bassa concentrazione aveva fatto rinvenire alterazioni neuro-comportamentali più lievi, in alcuni casi recuperabili, è stato interessante verificare gli effetti di questa stessa concentrazione in un trattamento cronico (21 giorni). Nel corso di tale trattamento, il feeding di Carassius carassius era drasticamente ridotto, rispetto ai controlli, a partire dal giorno 7 di esposizione mentre in Thalassoma pavo la riduzione diveniva elevata al giorno 14. A livello encefalico, si riscontrava una più estesa degenerazione che colpiva molti più campi neuronali, compreso il nucleo diffuso del lobo inferiore (NDLI). Al contempo, il trattamento cronico era responsabile di una generalizzata up-regulation dell’HSP90 in Thalassoma pavo e di un effetto trascrizionale sito-specifico in Carassius carassius. In quest’ultimo teleosteo, infatti, si riportavano down-regulations nel telencefalo (~-30%) e in NDLI (-55%), ed upregulations in TLo (+30%), VCe (+43%) e nel corpo del cervelletto (CCe; +52%). La somministrazione di ORX-A al 21 giorno, sebbene causasse un’attenuazione degli effetti del Cu2+ sul comportamento, non era però capace di ridurre i danni neuronali e, a livello trascrizionale, non influenzava in modo efficiente l’espressione dell’HSP90 Nel complesso, i risultati di questo lavoro di Dottorato forniscono importanti evidenze degli effetti neuro-comportamentali del Cu2+ in Carassius carassius e Thalassoma pavo, sottolineando il coinvolgimento dell’HSP90 nei meccanismi di protezione e riparazione innescati a livello encefalico. In aggiunta a ciò, per la prima volta, si suggerisce l’implicazione del sistema ORXergico nell’attivazione di risposte adattative allo stress indotto dal Cu2+, sia nei teleostei marini che d’acqua dolce
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    Meccanismi di Cross-talking tra i sistemi Orexinergico e GABAergico nei teleostei
    (2014-03-25) Crudo, Michele; Canonaco, Marcello; Facciolo, Maria
    The neuropeptides hypocretins/orexins (ORX) are known to control state-dependent activities such as sleep-wakefulness, energy homeostasis and reward/addiction processes. To date, interests regarding ORXergic neuronal functions have mostly dealt with mammals, while only recently attention is beginning to be directed towards aquatic vertebrates. On this basis, the intention of the present study was to evaluate ORX-A effects on behavioral and neuronal activities in marine (the ornate wrasse, Thalassoma pavo) and freshwater (the goldfish, Carassius auratus) teleost fishes. To achieve such aims behavioral, molecular and neurodegenerative analysis were performed following intraperitoneal injections of not only the most effective doses of ORX-A, but also of GABAAR β subunit agonist muscimol (MUS) and antagonist bicuculline (BIC) as well as a classical benzodiazepine, diazepam (DZP), and a non benzodiazepine, zolpidem (ZOL), that are instead agonists of the GABAAR α subunits. Behavioral studies on explorative behaviors (swimming towards food sources; STF), free swimming (FS) and on resting states (R) displayed that ORX-A was responsible for very great (p<0.001) enhancements of STF in both teleosts while similarly very great and great (p<0.01) reduction of R was detected in wrasse and goldfish, respectively. Interestingly, ORX-A effects showed to be strongly influenced by environmental photoperiodic conditions as pointed out by behavioral and ORXR expression relationships in wrasses during constant light/dark conditions. In this case, ORX-A/photoperiodic-dependent motor behaviors might be related to a structural-functional dichotomy of some motor-controlling brain regions. Indeed during the day, ORX-A might be very likely promoting the awakening state via low-affinity ORXR sites at hypothalamic (HTH) and mesencephalic (MES) levels so inducing the promotion of STF and FS. On the other hand, during the night ORX-A might result in a promotion of R via activation of mostly telencephalic (TEL) high-affinity sites. As far as GABAAR influence is concerned, MUS was capable of inducing a moderate (p<0.05) increase in STF and this tends to not only underlie a highly conserved GABA stimulus on feeding but also that such an activity relies on the involvement of ORXR in most brain regions of both fish models. Moreover, it was also possible to observe that such a GABAAR agonist elicits a neuroprotection via ORXR as suggested by both the reduction of BIC-dependent mRNA down-regulations and the very low argyrophilic reactions in brain regions of MUS+BIC-treated fish. When the increase of STF was next checked to see whether it was linked to an enhancement of food consumption, I observed that ORX-A and GABAAR  drugs (MUS and BIC) did not modify this activity. On the other hand, GABAAR  subunits appeared to not only influence STF maneuvers but also food consumption as demonstrated by ZOL and DZP evoking very great increases in STF coupled with great and very great amounts of food consumption, respectively. Interestingly, also in 8 this case ZOL- and DZP-dependent hyperphagia seemed to be correlated to ORXR expression variations in mostly HTH and MES, brain areas that are involved in energy homeostasis and motor activities. At this point it was interesting to investigate if ORX- and GABAAR-induced STF effects were mediated through rewarding pathways like that reported for mammals. With such an aim, T-maze and Conditioned Place Preference (CPP) paradigms were performed. For this part, ORX-A accounted for a moderate improvement of T-maze performances that became great when associated to color visual stimuli, suggesting that ORX-A might be operating on memory processes also in fish. Moreover from CPP analysis in which ORX-A acted as a main agent responsible for great increase of color-dependent change in CPP, it seems that this neuropeptide and not GABAAR drugs, might be potentiating reward pathways in goldfish. Also in this case, behavioral performances are consistent with ORXR up-regulations in some TEL regions and in the nucleus of the posterior tuberculum, homologous of the amygdala plus hippocampus and ventral tegmental area that in mammals control learning and reward processes. It is worthy to note that DZP only accounted for a moderate increase in CPP change while BIC completely blocked ORX-A-induced change in CPP and this tends to point to a dual neurosignaling mechanism between ORX circuit and GABAAR / subunits on motivational-reward behaviors. Overall these results highlight, for the first time, not only an ORX neuronal driving force operating on feeding behaviors in goldfish, but above all its participation in the control of goal-oriented behaviors like in mammals.