Tesi di Dottorato
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Item GPER mediates the up-regulation of acid synthase (fasn) intuced by 17B-estradiol in cancer cell and in cancer-associated fibroblasts (CAFs)(2012-11-26) Santolla, Maria Francesca; Maggiolini, Marcello; Sisci, DiegoActivation of lipid metabolism is an early event in carcinogenesis and a central hallmark of many tumors. Fatty acid synthase (FASN) is a key lipogenic enzyme catalyzing the terminal steps in the de novo biogenesis of fatty acids. In cancer cells, FASN may act as a metabolic oncogene given that it confers growth and survival advantages to these cells, whereas its inhibition effectively and selectively kills tumor cells. Hormones like estrogens and growth factors contribute to the transcriptional regulation of FASN expression also through the activation of downstream signaling and a crosstalk among diverse transduction pathways. In this study, we demonstrate for the first time that 17β-estradiol (E2) and the selective GPER ligand G-1 regulate FASN expression and activity through the GPER-mediated signaling which involved the EGFR/ERK/c-fos/AP1 transduction pathway, as ascertained by using specific pharmacological inhibitors, performing gene-silencing experiments and ChiP assays in breast SkBr3, colorectal LoVo, hepatocarcinoma HepG2 cancer cells and breast cancerassociated fibroblasts (CAFs). In addition, the proliferative effects induced by E2 and G-1 in these cells involved FASN as the inhibitor of its activity, named cerulenin, abolished the growth response to both ligands. Our data suggest that GPER may be included among the transduction mediators involved by estrogens in regulating FASN expression and activity in cancer cells and CAFs that strongly contribute to cancer progression.Item Study of the expression of a Small Leucin-Rich Proteoglycan, Asporin, in normal human osteoblasts and regulation by breast cancer cells(2014-11-17) Trombino, Giovanna Elvi; Sisci, Diego; Bellahcène, Akeila; Lanzino, MarilenaAsporin (ASPN) is an extracellular matrix protein that belongs to the Small Leucine Rich Repeat proteoglycan (SLRP) family. Asporin is abundantly expressed in the articular cartilage of individuals with osteoarthritis. In the context of osteoarthritis, several studies have shown that asporin regulates cartilage matrix gene expression and cartilage formation by modulating the transforming growth factor-β (TGF- β) signaling pathway. Asporin directly binds to TGF‐β and inhibits TGF-β-mediated expression of cartilage matrix genes. Previous studies in our laboratory, showed that Asporin inhibits TGF- β-1-mediated SMAD2 phosphorylation in breast cancer cells as well as migration and epithelial to mesenchymal transition in A549 human lung cancer cells. The present study was undertaken to investigate whether asporin secretion could indirectly mediate the ability of metastatic breast cancer cells to regulate osteoblastic differentiation. The Wnt antagonist sclerostin (SOST) is a potent inhibitor of bone formation. We considered the possibility that the balance between ASPN and SOST present in the ECM may create a specific environment favorable to aggressive breast cancer cell growth. Results: Breast cancer cells do not produce ASPN themselves but they regulate its expression in osteoblasts. Normal human osteoblasts have been cultured in presence of MCF7 and MDA-MB-231 serum-free conditioned medium. Immunoblot analysis and real time PCR, revealed a significant increase in ASPN expression and secretion in osteoblasts treated with MCF7-conditioned medium, while the opposite effect was observed with MDA-MB-231-conditioned medium. We investigated the role of MCF7 and MDAMB231 conditioned media in osteoblast differentiation and mineralization through alkaline phospatase and Runx2 expression. Our results showed the ability of MCF7 conditioned medium to induce the osteoblast differentiation and mineralization compared to the MDA-MB-231 conditioned medium treatment. Osteoblasts treated with MCF7 conditioned medium and challenged with recombinant SOST showed a significant reduction in their differentiation potential through the decrease of ASPN expression. Contrarily to non-metastatic MCF-7 breast cancer cells, MDA-MB-231 metastatic breast cancer cells inhibited the secretion of ASPN by osteoblasts through the overexpression of SOST. The result is the reduction of osteoblast differentiation and mineralization that can create a specific environment favorable to aggressive breast cancer cell growthItem L'uso di biomateriali innovativi per la veicolazione di farmaci antitumorali(2014-12-01) Tavolaro, Palmira; Sisci, Diego; Andò, Sebastiano; Panno, Maria Luisa; Tavolaro, AdalgisaItem Characterization of the role of ageing on mechanical and thermal nociception and nocifensive response to formalin test in C57BL/6 Mice(2014-10-27) Scuteri, Damiana; Sisci, Diego; Berliocchi, LauraIl dolore cronico, che riduce notevolmente la qualità della vita, interessa un vasto segmento della popolazione globale (il 25% della popolazione Europea e più di 100 milioni di cittadini Americani), diventando anche più frequente negli anziani (> 65 anni). In questa popolazione, il dolore cronico spesso viene incompreso e non opportunamente trattato (Bruckenthal & D’Arcy, 2007), anche a causa della resistenza alla maggior parte degli analgesici di elezione. Pertanto, questo progetto di dottorato è stato condotto con l’obiettivo di caratterizzare un modello di dolore cronico che potesse essere un valido strumento rappresentativo della condizione di dolore cronico nell’anziano ed il ruolo dell’invecchiamento nella nocicezione meccanica e termica e nella risposta nocifensiva in topi C57BL/6. Topi C57BL/6 di due mesi di età sono stati sottoposti al Test della Formalina (Dubuisson & Dennis, 1977): oltre a studiare il comportamento nocifensivo di licking/biting/flinching indotto dalla formalina, l’allodinia meccanica e l’edema sviluppati dagli animali in seguito alla somministrazione di formalina sono stati rispettivamente investigati tramite il Test di Von Frey (Chaplan et al., 1994) e l’utilizzo di un calibro, nel 1°, 4°, 7°, 9°, 11° e 14° giorno successivo alla somministrazione di formalina. Inoltre, è stata studiata l’efficacia del gabapentin, uno dei trattamenti di scelta per gli stati di dolore cronico come la neuropatia diabetica e la nevralgia postherpetica (Backonja et al., 1998; Rowbotham et al., 1998), sia nella risposta nocifensiva al test della formalina sia nella conseguente allodinia meccanica, fino a 4 giorni dopo l’iniezione di formalina. I risultati ottenuti hanno dimostrato la presenza di allodinia meccanica nella zampa ipsilaterale già due ore dopo la somministrazione di formalina, con il picco nel 4° giorno. Questa allodinia meccanica a lungo termine (fino a 14 giorni), nel 4° giorno successivo all’iniezione di formalina, interessa anche la zampa controlaterale, confermando l’esistenza di meccanismi centrali ritenuti alla base della seconda fase del test della formalina ed escludendo la possibilità che tale allodinia possa essere causata dall’edema evidenziato. Il gabapentin è risultato molto efficace nella seconda fase, lievemente efficace nella prima fase e nell’allodinia meccanica indotta dalla formalina 2 ore dopo la somministrazione di formalina. Tale attività non è stata evidenziata nel primo e nel quarto giorno successivo all’iniezione di formalina, verosimilmente a causa dell’emivita del farmaco. I nostri risultati caratterizzano il test della formalin come un modello rappresentativo di uno stato di dolore cronico che racchiude sia le caratteristiche infiammatorie del dolore articolare, spesso resistente al trattamento (Scaglione et al., 2014), sia gli aspetti centrali del dolore neuropatico, perciò molto utile per studiare le condizioni di dolore cronico che affliggono un crescente numero di pazienti anziani. Inoltre, il quadro fisiopatologico del dolore nell’anziano è stato approfondito per comprendere come l’invecchiamento potesse influenzare prima la nocicezione e, successivamente, lo sviluppo ed il mantenimento del dolore, dal momento che i cambiamenti nella nocicezione indotti dall’età non sono ancora ben noti (Taguchi et al., 2010). Pertanto, topi C57BL/6 giovani (2 mesi) e più anziani (6, 12 e 18 mesi) sono stati sottoposti a test comportamentali per determinare la sensibilità basale meccanica e termica (test di Von Frey (Chaplan et al., 1994), Pin-prick test (Chan et al., 1992), test di Hargreaves (Hargreaves et al., 1988), test dell’acetone (Choi et al., 1994)). Come dimostrato anche da studi longitudinali, soprattutto la sensibilità meccanica ed anche quella termica (sia al caldo che al freddo) sono risultate incrementate. I primi cambiamenti evidenti, in particolare per la sensibilità al freddo, sono stati osservati intorno ai 6 mesi di età. Fra l’età di 12 e di 18 mesi, i livelli di sensibilità hanno mostrato una sorta di plateau, con un incremento molto più lento. Poiché la nocicezione è risultata essere modificata negli animali anziani, si è deciso di esaminare l’effetto dell’età sulla risposta nocifensiva al dolore evocato (test della formalina). La risposta nocicettiva, espressa in secondi di licking/biting/flinching e come totale di eventi di licking/biting/flinching, è risultata differente nei topi anziani (6, 12, 18 mesi), presentando non più solo 2 ma 3 fasi di picco, uno spostamento temporale ed un’ampiezza variata. Inoltre, lo stato allodinico formalina-indotto è risultato più pronunciato nei topi anziani, nei quali l’allodinia meccanica ha continuato ancora a rimanere stabile al picco, mentre nei topi di due mesi il recupero stava già cominciando. Anche il processo di guarigione e l’edema della zampa sono risultati influenzati dall’età dell’animale. A livello molecolare, non sono state evidenziate differenze significative nei livelli della proteina p62, di LC3- I e di LC3-II, mentre solo i livelli di espressione di Beclin 1 sono risultati progressivamente ridotti con l’invecchiamento, in maniera statisticamente significativa. Sebbene siano necessari ulteriori esperimenti, questi risultati sembrano suggerire che la pathway dell’autofagia sia modificata e che il flusso autofagico sia probabilmente ridotto. Di fondamentale importanza è l’osservazione che il principale marker di dolore cronico, la subunità del canale del Ca2+ α2δ-1, è risultata quasi assente nei topi di 2 mesi e notevolmente up-regolata, seguendo un andamento a campana, nei topi di 6 e di 12 mesi. Questo fenomeno potrebbe essere alla base della ridotta soglia meccanica dei topi più anziani. Inoltre, una nuova banda a basso peso molecolare, che abbiamo chiamato α2δ-1*, è risultata altamente presente nei topi più anziani rispetto ai topi di due mesi, come la banda nota α2δ-1. I nostri risultati hanno dimostrato che anche l’efficacia del gabapentin (10 e 100 mg/Kg) nel test della formalina e nell’allodinia meccanica indotta dalla formalina, testato in topi C57BL/6 di 2 e 6 mesi, è risultata influenzata dall’invecchiamento. In particolare, nei topi giovani, solo la dose di 100 mg/Kg è risultata efficace in tutte le fasi del test della formalina, mentre, sia la dose più alta che la dose più bassa sono state efficaci nei topi di 6 mesi. A differenza dei topi di due mesi, i topi di 6 mesi non hanno mostrato cambiamenti significativi fra la soglia meccanica dei topi trattati con veicolo e quella dei topi trattati con il farmaco due ore dopo la somministrazione di formalina. Tuttavia, la somministrazione acuta di gabapentin è risultata più efficace sull’allodinia meccanica indotta dalla formalina nei topi di 6 che nei topi di 2 mesi, suggerendo che nei topi anziani, anche una dose più bassa di gabapentin risulta terapeutica ma l’effetto terapeutico ha più breve durata. Questo fenomeno potrebbe essere dovuto all’up-regulation della subunità α2δ-1 evidenziata nei topi anziani. In conclusione, i risultati ottenuti durante questo progetto di ricerca di dottorato caratterizzano il test della Formalina (Dubuisson & Dennis, 1977) come un valido modello di dolore cronico e dimostrano che il processo di invecchiamento influenza la soglia nocicettiva agli stimoli sia di natura meccanica che termica ed il comportamento nocifensivo in tale modello sperimentale di dolore cronico. I nostri risultati sono dotati di un notevole valore traslazionale per rispondere al bisogno, non ancora soddisfatto, di un migliore sfruttamento degli strumenti farmacologici già disponibili e di nuovi trattamenti terapeutici per la gestione del dolore cronico nei pazienti anziani.Item Effects of adiponectin on the progression of breast cancer: role of Estrogen Receptor alpha(2014-11-28) Ricchio, Emilia; Sisci, Diego; Mauro, LoredanaAdipose tissue is no longer considered an inert tissue for storing energy but is now recognized as an active endocrine organ secreting adipokines, cytokines and a diverse range of inflammatory markers. Adiponectin is one of the adipokines secreted by white adipose tissue and has been suggested to improve insulin sensitivity, regulate glucose and lipid metabolism and might play a role in the development of diabetes and atherosclerosis. In addition, it appears to play an important role also in the development and progression of several obesity-related malignancies, including breast cancer. In the present study, we demonstrated that adiponectin induces a dichotomic effect on breast cancer growth. Indeed, it stimulates growth in ERα-positive MCF- 7 cells while it inhibits proliferation of ERα-negative MDA-MB-231 cells. Notably, only in MCF-7 cells adiponectin exposure exerts a rapid activation of MAPK phosphorylation, which is markedly reduced when knockdown of the ERα gene occurred. In addition, adiponectin induces rapid IGF-IR phosphorylation in MCF-7 cells, and the use of ERα siRNA prevents this effect. Moreover, MAPK activation induced by adiponectin was reversed by IGF-IR siRNA. Coimmunoprecipitation studies show the existence of a multiprotein complex involving AdipoR1, APPL1, ERα, IGF-IR, and c-Src that is responsible for MAPK signaling activation in ERα-positive breast cancer cells. It is well known that in addition to the rapid effects through non-genomic mechanisms, ERα also mediates nuclear genomic actions. In this concern, we demonstrated that adiponectin is able to transactivate ERα in MCF-7 cells. We showed the classical features of ERα transactivation: nuclear localization, downregulation of mRNA and protein levels, and upregulation of estrogen dependent genes. Finally we demonstrate that in vivo adiponectin (1 and 5 μg/ml) induces a significant reduction (60 and 40%, respectively) in tumor volume in animals injected with human ERα-negative MDA-MB-231 cells, whereas an increased tumor growth (54 and 109%, respectively) is observed in the animals receiving human ERα-positive MCF-7 cells. Moreover, cyclin D1 (CD1) mRNA and protein levels are decreased in MDA-MB-231 cells, while they are upregulated in MCF-7 cells by adiponectin. Collectively, this study clarifies the molecular mechanism through which adiponectin modulates breast cancer cell growth, providing evidences on the celltype dependency of adiponectin action in relationship to ERα status.Item IGF system regulates GPER expression and function in cancer cells(2014-11-28) De Marco, Paola; Maggiolini, Marcello; Sisci, DiegoItem Transcriptional regulation by inositol polyphosphates(2014-10-27) Anselmo, Wanda; Sisci, Diego; Resnick, AdamItem Estrogen Receptor beta, through Sp1, recruits a corepressor complex to the Estrogen Receptor alpha gene promoter in breast cancer cells(2012) Zito, Domenico; Sisci, Diego; Andò, SebastianoHuman Estrogen receptors alpha (α) and beta (β) are essential components of a complex signal transduction pathway that regulates mammary growth and development. Several studies have reported that normal breast tissues display a relative higher expression of ERβ than ERα, which drastically changes during breast tumorogenesis. Thus, it is reasonable to suggest that a dysregulation of the two estrogen receptor subtypes may induce breast cancer development. However, the molecular mechanisms involved in the potential opposing roles played by the two estrogen receptors on tumor cell growth still needs to be elucidated. In the present study, we have demonstrated that ERβ overexpression in breast cancer cells decreases cell proliferation and down-regulates ERα mRNA and protein content, with a concomitant repression of estrogen-regulated genes. Transient transfection experiments, using a vector containing the human ERα promoter region, showed that elevated levels of ERβ down-regulated basal ERα promoter activity. Furthermore, site-directed mutagenesis and deletion analysis revealed that the proximal GC-rich motifs at −223 and -214 are critical for the ERβ-induced ERα down-regulation in breast cancer cells. This occurred through ERβ-Sp1 proteinprotein interactions within the ERα promoter region and the recruitment of a corepressor complex containing the nuclear receptor corepressor NCoR, accompanied by hypoacetylation of histone H4 and displacement of RNA polymerase II. Silencing of NCoR gene expression by RNA interference reversed the down-regulatory effects of ERβ on ER α gene expression and cell proliferation Collectively, these results suggest a novel mechanism by which overexpression of ERβ, through NCoR, is able to down regulate ERα expression, thus repressing ERα’s main role on breast cancer cell growthItem Preparazione di nuovi biomateriali: membrane zeolitiche ibride e cristalli per adsorbimento di farmaci di interesse oncologico(2012-11-20) Riccio, Ilaria Iolanda; Sisci, Diego; Tavolaro, Adalgisa; Aquila, Saveria; Tavolaro, PalmiraItem Bisphenol A induces gene expression changes an proliferative effects through GPER in breast cancer celles and cancer-associated fibroblasts(2012) Pupo, Marco; Maggiolini, Marcello; Sisci, DiegoBisphenol A (BPA) is the principal constituent of baby bottles, reusable water bottles, metal cans, and plastic food containers. BPA exerts estrogen-like activity by interacting with the classical estrogen receptors (ER and ER ) and through the G protein-coupled receptor (GPR30/GPER). In this regard, recent studies have shown that GPER was involved in the proliferative effects induced by BPA in both normal and tumor cells. In this study we evaluated the transduction pathways through which BPA influences cell proliferation and migration in human breast cancer cells and cancer-associated fibroblasts (CAFs), that lack the classical ERs. Specific pharmacological inhibitors and gene-silencing procedures showed that BPA induces the expression of the GPER target genes cFOS, EGR1, and CTGF through the GPER/EGFR/ERK transduction signaling in SKBR3 breast cancer cells and CAFs. Moreover, we observed that GPER is required for growth effects and migration stimulated by BPA in both cell types. Our results indicate that GPER is involved in the biological action elicited by BPA in breast cancer cells and CAFs. Hence, GPER-mediated signaling should be included among the transduction mechanisms through which BPA may stimulate cancer progression