Tesi di Dottorato
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Item <> catestatina migliora la risposta Frank-Starling in cuori di ratto normotesi e ipertesi agendo come attivatore fisiologico del pathway trasduzionale ossido nitrico-dipendente(16-12-2015) Cantafio, Patrizia; Canonaco, Marcello; Angelone, TommasoThe myocardial response to mechanical stretch (Frank-Starling law) is an important physiological cardiac determinant. Modulated by many endogenous substances, it is impaired in the presence of cardiovascular pathologies and during senescence. Catestatin (CST: hCgA352-372), a 21-amino-acid derivate of Chromogranin A (CgA), displays hypotensive/vasodilatory properties and counteracts excessive systemic and/or intra-cardiac excitatory stimuli (e.g., catecholamines and endothelin-1). CST, produced also by the myocardium, affects the heart by modulating inotropy, lusitropy and the coronary tone through a Nitric Oxide (NO)-dependent mechanism. This study evaluated the putative influence elicited by CST on the Frank-Starling response of normotensive Wistar Kyoto (WKY) and hypertensive (SHR) hearts by using isolated and Langendorff perfused cardiac preparations. Functional changes were evaluated on aged (18-month-old) WKY rats and SHR which mimic human chronic heart failure (HF). Comparison to WKY rats, SHR showed a reduced Frank-Starling response. In both rat strains, CST administration improved myocardial mechanical response to increased end-diastolic pressures. This effect was mediated by EE/IP3K/NOS/NO/cGMP/PKG, as revealed by specific inhibitors. CST-dependent positive Frank-Starling response is paralleled by an increment in protein S-Nitrosylation, AKT/eNOS/nNOS and PLN phosphorylations. Our data suggested CST as a NO dependent physiological modulator of the stretch-induced intrinsic regulation of the heart. This may be of particular importance in the aged hypertrophic heart, whose function is impaired because of a reduced systolic performance accompanied by delayed relaxation and increased diastolic stiffness.Item Modified amino acids as useful tool for peptide synthesis and their measurement in complex matrices(2012-11-28) Spinella, Mariagiovanna; Gabriele, Bartolo; Liguori, AngeloNegli ultimi anni sono stati scoperti e caratterizzati numerosi peptidi biologicamente attivi che, mediante interazioni con opportuni recettori, influenzano le cellule in una serie di funzioni vitali quali il metabolismo, le difese immunitarie, la proliferazione cellulare. Questi peptidi, tuttavia, nella loro forma nativa non possono essere utilizzati come farmaci, data la loro scarsa stabilità metabolica e il difficile assorbimento dopo somministrazione orale; bisogna perciò disporre di pepdidomimetici, che siano in grado di mimare gli effetti farmacologici dei peptidi naturali, ma che presentino allo stesso tempo una maggiore stabilità e biodisponibilità. Nella realizzazione della sintesi peptidica riveste un ruolo importante la scelta di gruppi protettori utili a mascherare la funzione amminica e carbossilica di amminoacidi e peptidi. La necessità di una sequenziale protezione e deprotezione delle varie funzionalità presenti fa si che, sia l’introduzione, che la rimozione di un gruppo protettore richiedano un’accurata progettazione sintetica, al fine di garantire il grado richiesto di ortogonalità tra i vari gruppi protettori utilizzati. Nella maggior parte dei casi per proteggere la funzione carbossilica di α-amminoacidi si utilizzano gruppi protettori semipermanenti che rimangono inalterati durante la costruzione della catena peptidica e vengono rimossi alla fine della sintesi. La formazione di esteri è stata allo scopo ampiamente utilizzata. In particolare il gruppo carbossilico viene convertito in estere metilico, benzilico, tert-butilico e benzidrilico. Tuttavia, il ripristino della funzione carbossilica al termine della sintesi peptidica presenta delle difficoltà. Infatti, in questi casi la deprotezione della funzione carbossilica prevede l’idrolisi basica degli stessi esteri in presenza di solventi organici. Questa procedura, anche quando è eseguita in condizioni strettamente controllate, può causare epimerizzazione del peptide e altre reazioni collaterali. Allo scopo è stata realizzata la deprotezione della funzione carbossilica di esteri metilici di alfa-amminoacidi utilizzando ilidi allo zolfo in particolare la dimetilsulfossonio metilide. In un tipico esperimento l'estere metilico della N-nosil-L-alanina è stato trattato con la metilide di dimetilsolfossonio in THF nel rapporto molare 1:2 per trenta minuti. A seguito di idrolisi acida si recupera con resa quantitativa il corrispondente amminoacido deprotetto sulla funzione carbossilica. La reazione è stata applicata ad una serie di esteri metilici di alfa-amminoacidi protetti sulla funzione amminica con il gruppo terbutossicarbonile (Boc), nosile (Ns)e benzilossicarbonile (Cbz) e di esteri metilici di acidi carbossilici. In tutti gli esperimenti eseguiti il corrispondente acido carbossilico è stato recuperato con rese elevate e in forma pura. La deprotezione della funzione carbossilica è stata realizzata con successo anche con substrati amminoacidici protetti in catena laterale con gruppi protettori acido-labili. Inoltre, eseguendo la procedura su substrati enantiopuri, è stato dimostrato che la reazione avviene senza racemizzazione. Questa metodologia è generale e può essere considerata una valida alternativa all'idrolisi degli esteri quando un substrato è sensibile alle condizioni di idrolisi. La dimetilsulfossonio metilide è stata usata, anche, come unico ed utile reagente per la deprotezione simultanea della funzione carbossilica protetta come estere e della funzione amminica protetta con il 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) di α-amino acidi e oligopeptidi. La nuova metodologia è stata applicata con successo nella sintesi peptidica, basata sulla “Fmoc-chemistry”, sia in fase solida che in soluzione. I corrispondenti amminoacidi e peptidi liberi sulla funzione carbossilica e sulla funzione amminica vengono recuperati in tempi brevi ed in ottime rese. La nuova procedura è stata applicata con ottimi risultati, anche, su peptidi contenenti amino acidi protetti in catena laterale con gruppi protettori acido-labili. Inoltre, è stato studiato l’andamento stereochimico della reazione di deprotezione mediante risonanza magnetica nucleare (1H-NMR). I dati 1H-NMR di miscele di prodotti diastereoisomerici tra di loro indicano chiaramente che le condizioni adottate non causano epimerizzazione degli stereocentri presenti nei substrati di partenza. Nel mio lavoro di ricerca mi sono occupata, inoltre, dello sviluppo di nuove metodologie per la sintesi di amminoacidi N-alchilati, utili building blocks per la sintesi di peptidi biologicamente attivi. In questo campo è stata messa a punto un' efficiente metodologia "one-pot" per l’ N-alchilazione di una serie di N-arilsolfonil-α-amminoacidi metil esteri recanti sostituenti diversi in posizione 4 dell'anello aromatico solfonammidico. In particolare, si è confrontata la reattività di queste specie con diazometano e trimetilossonio tetrafluoroborato in processi di N-metilazione e con trietilossonio tetrafluoroborato in processi di N-etilazione. La metilazione con diazometano ha avuto esito negativo per i derivati N-arilsolfon-ammidici contenenti gruppi elettron-donatori sull'anello aromatico. In questi casi il trimetilossonio tetrafluoroborato si è mostrato il reagente di scelta per la N-metilazione diretta e quantitativa. Il trietilossonio tetrafluoroborato ha dimostrato essere un reagente molto efficace per la preparazione di N-etil derivati di tutti gli N-arilsolfonil-α-ammino acidi metil esteri testati. Nell’ultima parte del mio lavoro di ricerca mi sono occupata del riconoscimento e della misura di analiti contenuti in matrici di interesse alimentare. Nella carne il contenuto di amminoacidi liberi ed il contenuto di acidi grassi liberi sono due parametri importanti utilizzati per determinare la sua qualità. Questi composti hanno un ruolo molto importante nella definizione delle caratteristiche sensoriali dei prodotti a base di carne. E' stata sviluppata, a tale proposito, una procedura innovativa per la misurazione del contenuto di amminoacidi e acidi grassi liberi nella carne e nei prodotti a base di carne. La procedura messa a punto prevede un singolo esperimento per la determinazione simultanea del profilo degli acidi grassi e degli amminoacidi. Gli analiti di interesse sono rapidamente estratti dalla matrice carnea e derivatizzati usando il metil cloroformiato. Questo reagente consente la trasformazione dei due gruppi di analiti nei corrispondenti N-metilossicarbonil aminoacidi metil esteri ed esteri metilici degli acidi grassi, che possono essere facilmente estratti per la loro successiva identificazione e quantificazione. La misurazione dei derivati degli acidi grassi e degli amminoacidi ottenuti viene eseguita mediante GC/MS. Il principale vantaggio del protocollo messo a punto è la determinazione simultanea di due importanti classi di analiti che sono di grande importanza nell'analisi e caratterizzazione degli alimenti. In un altro lavoro sono poi stati messi a confronto alcuni parametri importanti quali il contenuto di amminoacidi liberi e ammine biogeniche di prodotti a base di carne stagionati industriali e fatti in casa. A questo scopo, la "soppressata" e la salsiccia", due tipici salumi stagionati prodotti nel Sud Italia, sono stati analizzati. Le salsicce fatte in casa hanno mostrato un livello più alto di ammine biogeniche libere rispetto al contenuto dei prodotti industriali, molto probabilmente perché la formazione di ammine biogeniche nei prodotti industriali è limitata dall'uso di colture starter. Le salsicce industriali sono caratterizzate, invece, da un più alto contenuto di amminoacidi liberi totali.Item Il ruolo della Cromogranina A e dei suoi peptidi derivati, Serpinina e Catestatina, nella fisiopatologia cardiaca(2012-11-24) Gentile, Stefano; Cerra, Maria Carmela; Angelone, Tommaso; Canonaco, MarcelloIl ruolo cardiovascolare della CgA e dei suoi peptidi bioattivi è stato ampiamente documentato. I livelli plasmatici di CgA (range fisiologico da 0.5nM a 5nM), inizialmente utilizzati nella pratica clinica come biomarker di tumori neuroendocrini (O’Connor and Bernstein, 1984; Stridsberg and Husebye, 1997), rappresentano anche un importante marker per le disfunzioni del sistema cardiocircolatorio come ad esempio l’ipertensione essenziale, le cardiomiopatie ipertrofico/dilatative e l’insufficienza cardiaca (Ceconi et al., 2002). Recentemente Jansson et al. (2009), e Rosjo et al. (2010), hanno dimostrato che i livelli di CgA nella sindrome coronarica acuta forniscono informazioni prognostiche indipendentemente dagli altri markers di rischio convenzionali. L’importanza della CgA nella biologia cardiaca è inoltre supportata dall’osservazione che la delezione del gene per la CgA nei topi provoca lo sviluppo di ipertensione, che può essere riportata a livelli fisiologici trattando gli animali con CST o reintroducendo il gene per la CgA in topi con background Chga-/- (Mahapatra et al., 2005). I livelli plasmatici di CgA aumentano in condizioni di eccessiva stimolazione del sistema simpatico, particolarmente evidente nell’insufficienza cardiaca. Ceconi et al. (2002) e Pieroni et al. (2007), hanno dimostrato che in pazienti affetti da insufficienza cardiaca le concentrazioni plasmatiche di CgA sono aumentate (10-20 nM; 500-1000ng/ml), e strettamente correlate alla severità della patologia. Al momento non sono però disponibili informazioni sugli effetti diretti della CgA intera sul cuore, e sui fattori che regolano la sua produzione e processamento a livello miocardico.Il presente lavoro ha quindi lo scopo di chiarire se, e in che misura, la CgA intera induce effetti diretti sulla performance cardiaca, e la possibilità di un processamento proteolitico intracardiaco stimolo-dipendente della proteina. Utilizzando ratti normotesi (WKY) e ipertesi (SHR), abbiamo valutato i) gli effetti miocardici e coronarici della CgA intera nel cuore di ratto isolato e perfuso secondo metodica Langendorff; ii) il pathway trasduzionale (Akt/NOS/NO/cGMP/PKG) coinvolto nel suo meccanismo d’azione; iii) il processamento intracardiaco della CgA in seguito a stimolazione -adrenergica con ISO. Dal processamento della CgA deriva una serie di peptidi bioattivi; fra questi i peptidi N-terminali VS-1/2, (VS-1 CgA1-76; VS-2 CgA1-113), e il peptide C-terminale CST (CgA352-372), hanno effetti cardioattivi. La CST promuove l’angiogenesi (Theurl et al., 2010), abbassa la pressione sanguigna (Mahapatra et al., 2005; Fung et al., 2010; Gaede and Pilowsky, 2012), riduce la contrattilità cardiaca (Angelone et al., 2008; Mazza et al., 2008; Imbrogno et al., 2010), e incrementa la sensibilità dei barocettori (Gayen et al., 2009a; Gaede and Pilowsky, 2010). Recentemente è stato scoperto un nuovo frammento derivato dalla CgA. A livello della regione C-terminale, altamente conservata, il clivaggio proteico ad opera delle pro-ormone convertasi (PC1/2/3), genera un frammento di 2.9 kDa, la “serpinina” (Ala26Leu), il quale può subire una modificazione all’estremità N-terminale per formare un residuo di piro-glutammato (pGlu23Leu o pGlu-serpinina) (Koshimizu et al., 2011a,b). La presenza di entrambe le forme di serpinina è stata rilevata in colture di cellule di ghiandola pituitaria (AtT20). Questi peptidi sono in grado di inibire la morte cellulare indotta da stress ossidativo (Koshimizu et al., 2011a), e di promuovere la biogenesi dei granuli secretori nelle cellule endocrine regolando l’espressione di un inibitore delle proteasi, la proteasi nexina-1 (PN-1), che previene la degradazione delle proteine dei granuli nell’apparato di Golgi. È stato osservato che i peptidi della serpinina agiscono attraverso il pathway AC/cAMP/PKA (Koshimizu et al., 2011b), suggerendo che il meccanismo eccitatorio indotto dalla serpinina potrebbe controbilanciare gli effetti antiadrenergici e cardioinibitori indotti dalla CST e VS-1. Ad oggi non esistono evidenze sperimentali sul possibile ruolo cardioattivo della serpinina; pertanto nel presente lavoro di tesi è stata valutata la presenza di questo peptide e delle sue forme alternative nel cuore di ratto; è stato inoltre osservato in che modo influenzano la performance miocardica e la vasoattività coronarica. La serpinina e la pGlu-serpinina inducono un effetto positivo dose-dipendente sulla contrazione (inotropismo) del cuore di ratto isolato e perfuso secondo metodica Langendorff e sui muscoli papillari isolati, nonché sul rilassamento (lusitropismo) miocardico. Questi effetti miocardici sono stati accompagnati da una lieve, ma non significativa, vasodilatazione coronarica. Un terzo peptide, la serpinina Ala29Gly, non ha influenzato la performance cardiaca a nessuna delle concentrazioni testate. Sia la serpinina che la pGlu-serpinina sembrano agire attraverso il pathway 1-AR/AC/cAMP/PKA. Questi dati evidenziano le proprietà cardio-circolatorie della serpinina e della pGlu-serpinina, fornendo ulteriori informazioni su come i peptidi CgA derivati possano, controbilanciandosi, regolare finemente l’attività cardiaca in risposta a stimoli -adrenergici.Il quadro clinico dei pazienti affetti da cardiopatie è complicato da un’altra patologia che si accompagna spesso alle cardiopatie, la sindrome metabolica. E’ stato constatato, infatti, che circa il 30% di pazienti con cardiopatia ischemica acuta sono affetti da sindrome metabolica (ad esempio diabete, obesità). Il peptide CgA derivato prancreastatina (CgA250-301, PST) (Tatemoto et al., 1986; O’Connor et al., 2005; Gayen et al., 2009b), svolge diverse funzioni a livello metabolico, in particolare sul metabolismo del glucosio (Tatemoto et al., 1986). Tuttavia non sembra avere effetti a livello cardiovascolare. Studi recenti hanno evidenziato il ruolo della PST e della CST nel regolare la secrezione di insulina mantenendo l’omeostasi fra l’effetto anti-insulina della PST, e gli effetti insulino-sensitizzante della CST. (Gayen et al., 2009b). È stata valutata la possibile azione della CST sul metabolismo lipidico che, come è ben noto, risulta alterato nei soggetti obesi. Le cellule adipose sono regolate dalle catecolamine attraverso quattro tipi di AR: 1, 2, 3 e 2 (Arner, 1999; Arner, 2005). L’attivazione dei recettori -AR, coinvolgento le proteine G stimolatorie, aumenta la produzione di cAMP; questo a sua volta attiva la PKA, la quale fosforila la lipasi ormone sensibile (HSL) causando l’idrolisi dei lipidi. Al contrario, l’attivazione dei recettori 2-AR, accoppiati a proteine G inibitorie, inducono effetti opposti sulla lipolisi (Lafontan et al., 1997; Stich et al., 1999, 2003; Lafontan and Langin, 2009). Pertanto l’azione netta delle catecolamine sulla lipolisi dipende dall’equilibrio fra recettori - e -AR (Arner, 2005). Normalmente l’azione lipolitica indotta dai recettori -AR prevale sull’azione -AR. Una continua stimolazione del sistema nervoso simpatico o un aumento delle catecolamine plasmatiche, è spesso associato alla desensitizzazione dei -AR (Mori et al., 2007). Studi in vivo hanno dimostrato che l’azione lipolitica delle catecolamine è ridotta nei soggetti obesi (Bougneres et al., 1997; Jensen, 1997). Il trattamento ripetuto con epinefrina induce soppressione della lipolisi, basale e indotta da epinefrina, sia in soggetti normopeso che obesi (Townsend et al., 1994). Anche negli studi in vitro la risposta lipolitica indotta dall’epinefrina è diminuita dal pretrattamento con la stessa molecola (Stallknecht et al., 1997). Sulla base di questi dati, è stato ipotizzato che l’aumentata massa adiposa dei topi iperadrenergici Chga-KO (Gayen et al., 2009a) possa rispecchiare la desensitizzazione dovuta all’aumento delle catecolamine circolanti (Mahapatra et al., 2005). I topi Chga-KO mostrano, nonostante gli elevati livelli circolanti di catecolamine e leptina, una notevole adiposità. Le catecolamine inibiscono la secrezione della leptina (Fritsche et al., 1998; Scriba et al., 2000; Couillard et al., 2002); la desensitizzazione del -AR potrebbe prevenire tale effetto, causando un aumento dei livelli di leptina e della massa adiposa, così come mostrato nei topi Chga-KO e in altri modelli sperimentali di obesità. Come osservato nei topi DIO (diet induced obesity), l’aumento di leptina circolante induce la desensitizzazione dei recettori per la leptina, possibile causa del fenotipo obeso dei topi Chga-KO. Sulla base di queste osservazioni, è stato ipotizzato che la CST possa ridurre l’obesità ripristinando la sensibilità dei recettori adrenergici e dei recettori per la leptina attraverso la normalizzazione dei livelli plasmatici di catecolamine e leptina. È stato infatti osservato che il trattamento cronico con CST induce una significativa riduzione della massa adiposa nei topi Chga-KO. Il trattamento con CST ha inoltre determinato una riduzione del peso corporeo e della massa adiposa anche nei topi DIO, senza alterare l’assunzione di cibo. Sia nei topi DIO che nei topi ob/ob, in cui l’obesità è dovuta all’incapacità di produrre leptina, la CST è in grado di incrementare gli effetti della leptina sul metabolismo e sul signaling del tessuto adiposo. Le nostre osservazioni suggeriscono che la riduzione della massa grassa dopo trattamento cronico con CST è dovuta ad un aumento della lipolisi e della mobilizzazione dei lipidi; inoltre sembra che la CST agisca attraverso i recettori 2-AR e i recettori per la leptina. In linea con tali osservazioni, la CST promuove l’ossidazione degli acidi grassi e il signaling della leptina.Item Amino function and side chain modifications of amino acids, and synthesis of thrombin inhibiting peptides(2008-10-07) Viscomi, Maria Caterina; Liguori, Angelo; Gabriele, BartoloItem Nuove strategie per la sintesi di peptidi e steroidi modificati(2007-11-16) Perri, Francesca; Loiguori, Angelo; Gabriele, BartoloItem Azione cardiaca della catestatina in Rana esculenta(2014-03-26) Barbieri, Sandra Francesca; Canonaco, Marcello; Gattuso, Alfonsina; Mazza, Rosa